ICS 11.220 CCS B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 4039—2021 禽偏肺病毒感染诊断技术 Diagnostic techniques for avian metapnumevirus infection 2021-12-15 发布 2022-06-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T4039—2021 体品命业求国全 目 次 前言 引言 1. 范围 规范性引用文件 3术语和定义 4 缩略语· 临床诊断 5.1 临床症状 5.2结果判定 6实验室诊断 6.1 样品采集 6.2 样品运输 6.3 样品存放 6.4 病毒分离 6.5 RT-PCR检测 6.6抗体ELISA检测 7综合判定 附录A（资料性) 病毒分离用溶液配制 附录B(资料性) aMPV感染VeroCPE 附录C(资料性) 琼脂糖凝胶配制 附录D(资料性) 检测aMPV通用型N基因引物扩增序列（228bp） NY/T4039—2021 全国农业食品标准 前平言 公共服务 厂食典通 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本文件起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、北京市农林科学院畜牧兽医研究所、中国动物 卫生与流行病学中心、青岛嘉智生物技术有限公司。 本文件主要起草人：高玉龙、王笑梅、刘爵、刘华雷、秦立廷、刘长军、王楷戍、王菁、祁小乐、潘青、韦莉、 蒋文明、王素春、李凯、高立、张艳萍、崔红玉。 II NY/T4039—2021 引言 禽偏肺病毒（Avianmetapneumovrus，aMPV)引起的疾病最早在火鸡上发现，其广泛存在于多种家 禽，火鸡是其主要的宿主，其次是鸡、鸭等。aMPV感染火鸡引起火鸡鼻气管炎（Turkeyrhinotracheitis， TRT）；感染鸡引起肿头综合征（Swollenheadsyndrome，SHS)，主要引发呼吸道症状和产蛋量下降。根 据aMPV吸附蛋白(G蛋白)基因的不同，将其分为A、B、C和D4个亚型。其中,A、B亚型在世界各地均 有广泛报道。欧洲主要流行A、B两种亚型的病毒，以B亚型为优势流行毒株；而C亚型aMPV主要在美 国、法国和韩国被报道；D亚型aMPV仅在法国被报道。感染鸡的主要以A型和B型aMPV为主。目 前，许多国家都有该病报道，我国也有报道。血清学检测结果表明，我国部分养殖场禽偏肺病毒抗体阳性 率高达100%，该病对我国养禽业的危害日益加重。由于该病在我国属于新发传染病，还没有标准化的病 原与抗体检测技术标准，阻碍了由禽偏肺病毒引起的火鸡鼻气管炎和鸡肿头综合征诊断、流行病学调查和 疫苗免疫效力的评估。基于此，特制定了本文件。 本文件的制定参考了OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》第3.3.15章（2018年)内容，并结合本单 位和国内外相关检测技术，制定了病毒分离、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)检测和抗体酶联免疫吸 附实验（ELISA)检测技术要求和规范，能满足我国禽偏肺病毒感染诊断的需求。 NY/T4039—2021 禽偏肺病毒感染诊断技术 1范围 本文件规定了鸡和火鸡感染禽偏肺病毒的临床诊断，以及禽偏肺病毒病毒分离、反转录-聚合酶链式 反应(RT-PCR)检测、抗体酶联免疫吸附实验(ELISA)检测技术要求。 本文件适用于禽偏肺病毒感染的诊断 2规范性引用文件 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于 （包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682 GB19489 实验 室生物安 3术语和定义 S 本文件没有需 要界定 RA 4缩略语 下列缩略语 适用于 aMPV:含 病毒 CEF:鸡月 纤维细 hickene CPE：致细胞 病变 DEPC：焦碳 yrocarl DMEM：达 养基Dall ELISA：酶联 吸附 PBS：磷酸盐缓 液hos RNA：核糖核酸（RiboMucle RT-PCR：反转录果 reaction) SHS：肿头综合征（S head TAE：Tris-乙酸缓冲液（ cetate-EL TRT：火鸡鼻气管炎（Turkey） rhinot cheitis) Vero：非洲绿猴肾细胞（Africangreenmonkeykidney 5临床诊断 5.1临床症状 5.1.1火鸡 aMPV感染火鸡，其典型的临床症状有用爪抓面部、打喷嚏、鼻漏、啰音、结膜炎、眶下窦肿胀和下颌水 肿，出现咳嗽和摇头。产蛋火鸡感染，会导致产蛋量下降，可降低到70%，伴有蛋壳质量下降和腹膜炎。 5.1.2鸡 aMPV单独感染鸡时，不一定能引起临床症状，合并感染其他常见病原微生物，如大肠杆菌、副鸡嗜血 杆菌等，会出现咳嗽、打喷嚏、流眼泪、斜颈及角弓反张、眶下窦及眶周围窦肿胀等肿头综合征症状。产蛋 鸡发病后，除产蛋量下降外，蛋壳颜色变淡。在一个地区和养鸡场呈逐渐蔓延流行的特点。单一感染时死 1 NY/T4039—2021 亡率较低（2%～5%），若继发其他细菌或病毒后死亡率高达25%。 5.2结果判定 火鸡或鸡出现5.1临床症状可初步判定为aMPV感染疑似病例，但由于引起同类症状的病原较多， 确诊需要进行实验室诊断。 6实验室诊断 6.1样品采集 6.1.1器材 6.1.1.1无菌棉签。 6. 1. 1. 2 一次性注射器。 6.1.1.3无菌剪刀。 6.1.1.41.5mL和15mL离心管。 6.1.1.5 5小型台式离心机。 6. 1. 1. 6 一20℃冰箱。 6.1.1.7-70℃冰箱。 6.1.1.8微量可调移液器（20μL～200μL和200μL～1000μL各1支）。 6.1.1.9一次性移液器吸头。 6.1.2试剂与材料 PBS(见附录A.1)，冰袋。 6.1.3咽喉拭子样品 将无菌棉签深入病禽或病死禽的喉头口及上颚裂来回刮擦3次，取咽喉分泌液及拭子一并放入盛有 0.8mLPBS（含有终浓度为3000IU/mL青霉素、3000μg/mL链霉素）的1.5mL离心管中，密封，编 号，待检。 6.1.4组织样品 可采集死亡禽或发病禽只的鼻甲骨、气管、肺脏等组织，采集病料时用无菌的剪刀剪取组织样品 2.0g～3.0g，采集的样品装入一次性灭菌的15mL离心管，密封，编号，待检。 6.1.5血液样本 用无菌注射器翅静脉采血1.0mL，直接将血液注入1.5mL离心管，加盖，编号，待检。血液样本仅 用于抗体检测。 6.2样品运输 样品采集后置于保温箱中，加人预冷的冰袋，密封，24h内送实验室。如未能在24h内送达实验室， 应冷冻样品，加冰袋低温运输。 6.3样品存放 下冰箱，血液样品需分离血清后一20℃以下冰箱保存，所有样品应避免反复冻融。 6.4病毒分离 6.4.1器材 6.4.1.1倒置显微镜。 6.4.1.2细胞培养箱。 0000 6.4.1.4细胞培养瓶。 6. 4. 1.5 5灭菌研磨器。 2 NY/T4039—2021 6.4.1.6 一20℃冰箱。 6.4.1.7 台式低温高速离心机。 6.4.1.8 ：450nm滤器。 6.4. 1.9 手动或电动移液装置。 6.4.2试剂与材料 6.4.2.1 PBS(见附录A.1)。 6. 4. 2.2 细胞培养液（见附录A.2）。 6. 4. 2.3 细胞维持液（见附录A.3） 6. 4.2.4 非洲绿猴肾细胞（Vero） 6.4.3 样品处理 6.4.3.1 咽喉拭子样品 样品在振荡器上月 刮烈振 2 .在4℃下1000r/min 离心10min，取上清液， 6.4.3.2组织样品 取待检样品 浓度 为3000IU/mL）和 链霉素（终浓度 的PB 全冻融 下1000r/min离 心10min，取 清 6.4.4接种细胞 取25cn 子的样品，置于 Y 37℃、5%C 王瓶内液行 首中培养。 6.4.5培养 养与观 察 每日观察 子细胞培养物反 复冻融3次，取 代～5代即可出 现CPE，进行 6.4.6结果判定 接种样品的 现 膜融合形成多个 性CPE时（见附录 B)，初步判定为病 离阳性 G5RTPCR 检测 性者，判为病毒分离 阳性。 6.5RT-PCR检测 6.5.1器材 6.5.1.1PCR扩增仪。 6.5. 1.2 台式低温高速离心机。 6.5.1.3 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。 6.5. 1. 4 凝胶成像仪或紫外透射仪。 6.5.1.5 一20℃冰箱。 6. 5. 1. 6 一70℃冰箱。 6.5. 1.7 1支)。 6.5.1.8 -次性移液器吸头。 6.5.1.9 PCR扩增管。 6.5.2试剂与材料 6.5.2.1TRIzol试剂、预混ExTag酶、MLV反转录酶、DEPC处理水、DL2000DNA分子量Marker均 3