ICS 11.220 CCS B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 4030—2021 动物土拉杆菌病诊断技术 Diagnostic techniques for animal tularemia 2021-12-15发布 2022-06-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T4030—2021 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 术语和定义 临床诊断 4.1 流行特点 4.2 临床症状 4.3 病理变化 4. 4 结果判定 5革兰氏染色检查 5. 1 材料准备 5. 2 操作方法 5. 3 结果判定 6细菌分离 6. 1 材料准备 6. 2 样品准备 6.3 接种培养 6. 4 生长特性 6.5 生化特性 6.6 结果判定 7 多重PCR 7. 1 材料准备 7. 2 样品前处理 7. 3 模板DNA制备 7. 4 操作方法 7. 5 结果判定 8 实时荧光PCR 8. 1 材料准备 8. 2 样品前处理 8.3 模板DNA制备 8.4 操作方法 8.5 结果判定 9 ELISA 9.1 器材 9.2 试剂 9.3 操作方法 9.4 结果判定 10综合判定. 附录A（资料性） 土拉杆菌病诊断方法的适用性 附录B(资料性) 土拉杆菌病简介 I NY/T4030—2021 附录C(资料性）试剂的配制 附录D(资料性）PCR扩增产物的参考序列 11 = NY/T4030—2021 言 公共服务 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口 本文件起草单位：中国动物卫生与流行病 中心 河南农业 吉林农业大学。 王娟、魏荣、魏战勇、高云航、马 宏伟、赵永攀。 II NY/T4030—2021 动物土拉杆菌病诊断技术 1范围 本文件规定了土拉杆菌病临床诊断、革兰氏染色检查、细菌分离、多重PCR、实时荧光PCR和ELISA 等诊断技术的要求。 本文件适用于家兔、野兔、小型啮齿类动物、绵羊、牛、猪、豹 向驼鹿和鸟类等动物土拉杆菌病的诊断。 各种诊断方法的适用性见附录A。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通这 成 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文 琪最 有的修改单)适用本文件。 Q GB/T6682分析 实验 室用水规 GB19489实验 要 3术语和定义 下列术语和定义运 五用于 3. 1 A 土拉杆菌病 tularemia nctsglla larensis）引起的 验 由土拉杆菌 工作应符合 H GB19489的规定 拉杆菌 CUL CEI 4临床诊断 4.1流行特点 4.1.1易感动物为免兔 家兔和 共是山鼠香鼠、松鼠和海 尤具 啮齿动物最易 感。A型土拉杆菌对 B型生王拉杆菌对人和家免的致 改病性 对较小。多种哺 乳动物、鸟类、两栖动物 4.1.2呈零星散发或地 性流行， 勾能发病·世多见手春未夏初，即吸而 否跃且非高温季节。 4.1.3人类发病前多有接角 食用 在白然疫源区（野 动物、家养动物和蜱、蝇、 虱子和蚊子等吸血昆虫和节肢动 多的地区 4.2临床症状 动物感染土拉杆菌后主要表现为发热、沉郁等症 通常会引起败血症。 4.3病理变化 4.3.1易感动物（如家兔、野兔免及小型啮齿类动物） 常见急性死亡，检可见以肝、骨髓和脾发生不规则分布的灰白色坏死灶为特征的败血症。脾脏通常 肿大，坏死灶大小不一，在有些病例中肉眼很难发现。肺脏通常充血、水肿，且可见器质性病变和纤维素性 肺炎或胸膜炎。淋巴结可见干酪样坏死，腹腔、胸腔和四肢的淋巴结最常见 4.3.2易感性较低动物（如绵羊、牛、猪、狗、驼鹿或鸟类） 肺脏、心包膜、肾脏、脾脏和肝脏中可见结核样肉芽肿，病变中心多见单灶性或多灶性坏疽，肉芽肿中 多为巨噬细胞，偶尔见淋巴细胞、中性粒细胞、多核巨细胞和成纤维细胞。 4.4结果判定 当动物符合4.1流行特点、出现4.2临床症状且具有4.3病理变化时，可判为临床诊断阳性。 1 NY/T4030—2021 5革兰氏染色检查 5.1材料准备 5.1.1器材 5.1.1.1显微镜。 5.1.1.2酒精灯。 5.1.1.3载玻片。 5.1.1.4盖玻片。 5.1.2试剂 5.1.2.13%盐酸酒精，配制方法见附录C中的C.1。 5.1.2.2结晶紫染色液，配制方法见C.2。 5.1.2.3革兰氏碘液，配制方法见C.3。 5.1.2.4沙黄复染液，配制方法见C.4。 5.2操作方法 5.2.1涂片制备 5.2.2革兰氏染色 涂片自然干燥后用3%盐酸酒精固定5min，水洗、干燥后作革兰氏染色镜检。滴加结晶紫染色液，染 1min，水洗。滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。滴加95%乙醇脱色15s～30s，直至染液被洗掉。不要 过分脱色。水洗。滴加沙黄复染液，复染1min，水洗。风干，镜检， 5.3结果判定 5.3.1阳性 发现革兰氏染色阴性，无芽孢、无鞭毛，大小为（0.7～1)um×（0.2～0.5)μm，以椭圆形为主的多形态 球杆菌，可判为土拉杆菌革兰氏染色检查阳性。 5.3.2阴性 未出现5.3.1结果则判为土拉杆菌革兰氏染色检查阴性。 6细菌分离 6.1材料准备 6.1.1器材 6.1.1.1显微镜。 6.1.1.2接种针。 6.1.1.3普通培养箱（或二氧化碳培养箱）。 6.1.2试剂 6.1.2.1弗朗西斯培养基，配制方法见C.5。 6.1.2.2麦康凯和查平氏（McCoyChapin)培养基，配制方法见C.6。 6.1.2.3改良Thayer-Marin琼脂，配制方法见C.7。 6.1.2.4胱氨酸牛心琼脂选择培养基，配制方法见C.8。 6.2样品准备 无菌采集患病动物的心血、肝、脾和骨髓，或者肺、心包膜、肾、肝、脾等处的土拉杆菌肉芽肿样品进行 培养，以死动物的样品为最佳。 2 NY/T4030—2021 6.3接种培养 无菌采集的样品接种于弗朗西斯培养基、麦康凯和查平氏（McCoyChapin)培养基、改良Thayer-Marin琼 脂，置于普通培养箱或二氧化碳培养箱（5%二氧化碳)37℃培养。污染样品可采用胱氨酸牛心琼脂选择 培养基。 6.4生长特性 土拉杆菌在弗朗西斯培养基和改良Thayer-Martin琼脂上生长良好，形成黏稠、乳白色、融合的菌落， 在McCoyChapin培养基上形成细小、凸起、圆形的透明菌落。土拉杆菌在普通培养基上不生长，但可在 加入胱氨酸、半胱氨酸血液或卵黄的培养基中生长。样品培养48h后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染 色。该菌不运动，无芽孢，两极着色，培养24h后菌体形态均匀一致，老龄培养菌则具多形性。 6.5生化特性 要半胱氨酸，可与土拉杆菌高免血清发生显著 凝集反应。 6.6结果判定 分离培养物最多培 对疑以菌 进 拉杆菌相似，且符 合6.4和6.5的，判定 拉杆菌细 日性；否则，判定为土 7 多重PCR 7.1材料准备 7.1.1器材 7.1.1. 1PCR折 7. 1. 1. 2 生物安 7.1.1.3凝胶成像 7. 1. 1. 4 消毒灭菌 7. 1. 1. 5 制冰机 核酸蛋白 折 7. 1. 1. 6 7. 1. 1. 7 高速冷冻 7. 1. 1. 8 台式小型离 U 7. 1. 1. 9 PCR反应管 7. 1. 1. 10 灭菌采样器 7. 1. 1. 11 微量加样器 7. 1. 2 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 7.1. 2. 1 实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规定） 7. 1. 2. 2 DNA提取试剂盒。 7.1.2.3 PCR反应预混合液（2XBuffer，含Taq酶、dNTPs及氯化镁）。 7.1.2.4DNA相对分子量标准物MarkerDL2000bpladder。 7.1.2.5电泳试剂 7.1.2.5.1电泳缓冲液，配制方法见C.9。 7.1.2.5.2上样缓冲液，配制方法见C.10。 7.1.2.5.3溴化乙锭，应用方法见C.11。 7.1.2.6土拉杆菌标准菌株或其DNA。 7.1.2.7PCR引物。商业合成的引物。 3