ICS 65.020 B 15 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 402—2016 代替NY/T402—2000 脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程 Code of practice for virus detection of virus-free sweet potato seed roots or plant 2016-11-01 发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 402—2016 前 創言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替NY/T402—2000《脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程》。与NY/T402—2000相 比，除编辑性修改外，主要技术变化如下： 增加了检测甘薯病毒种类（见1、4)； 增加了规范性引用文件（见2）； 对脱毒组培苗的定义进行了修改（见3.1,2000年版的2.1)； 删除了术语和定义中病毒病株允许率,增加了带毒率（见3.6)和病毒病显症率（见3.7)； 增加了病毒PCR检测方法(见6.3和附录C)和RT-PCR检测方法（见6.4和附录D)； 根据生产实际重新确定了原种和生产用种的质量标准（见7.3和7.4）。 本标准由农业部种子管理局提出并归口。 本标准起草单位：江苏徐州甘薯研究中心、河南省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：谢逸萍、张振臣、孙厚俊、乔奇、张成玲、秦艳红、赵永强、张德胜、徐振、王爽、 杨冬静。 本标准的历次版本发布情况为： -NY/T 402—2000。 I NY/T 402—2016 脱毒甘薯种薯（苗病毒检测技术规程 1范围 本标准规定了脱毒甘薯种薯（苗)病毒检测技术的术语定义、检测对象、抽样、检测方法和脱毒种薯 (苗）的质量标准。 本标准适用于脱毒甘薯种薯（苗）的甘薯羽状斑驳病毒（Srweetpotatofeatherymottle virus， SPFMV)、甘薯潜隐病毒（Sweet potato latent virus ,SPLV)、甘薯 G 病毒（Sweet potato virus G, SPVG)、甘薯褪绿斑病毒 SPCFV）、甘薯褪绿矮化病毒（Sveet pota- to chlorotic stunt vir 2 术语和定义 下列术语 和定 适 RES! 2. 1 人 脱毒组培苗 由茎尖分生 组织培 获得的未受甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）甘薯） 隐病 （ (SPLV)、甘薯G病 毒(SPVG) 甘 薯褪绿斑病毒（SPCEV甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）和甘 病毒（Sweepoviruses) 侵染的组培苗 R 2. 2 脱毒种薯 苗 virus-free seed root or pla 由脱毒组 咅苗绎 代紫殖生产 级别 2. 3 原原种 pr e-elite 用脱毒组培 生 产出的符合质量标准的 2. 4 R 原种 elite 用原原种在隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯（苗）。 2. 5 生产用种 certified seed 用原种在隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯(苗) 2. 6 带毒率 virus-carrying rate 各级别甘薯种薯(苗)受病毒侵染薯块(植株)的比率。 2. 7 病毒病显症率 virus-symptom rate 各级别甘薯种薯(苗)出现病毒病症状薯块(植株)的比率。 3检测对象 3.1甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)。 3.2甘薯潜隐病毒(SPLV)。 NY/T 402—2016 3.3甘薯 G病毒(SPVG)。 3.4甘薯褪绿斑病毒(SPCFV)。 3.5甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV)。 3.6甘薯双生病毒（Sweepoviruses）。 4抽样 4.1组培苗抽样 4.1.1脱毒组培苗 每个茎尖分生组织培养系应检测。 4.2田间抽样 4.2.1原原种田和原种田抽样 定植后30d、60d、收获前2周，采用五点取样法。面积<0.1hm²，抽取数量为200株；0.1hm²<面 积<1hm²，抽取数量为500株：超出1hm²面积，按0.1hm²<面积≤1hm²划区，每区抽取数量为500 株。每株取上、中、下部叶片1g～5g。 4.2.2生产用种田抽样 4.2.2.1种苗定植后30d、收获前两周取样检测。抽样标准见表1。 表1抽样数量标准表 种类 种薯(苗)总量，株 抽样百分率，% 抽样最低数量，株 000 01> 6~10 100 薯苗 >10 000 3~5 4.2.2.2没有经过田间检测的种薯（苗)应进行块根或种苗检测。抽样数量标准见表2。将第一次抽 取的样品混合后，进行二次抽样，随机抽取10%的混合样品检测。 表2抽样数量标准表 种类 种薯(苗)总量 抽样百分率，% 抽样最低数量 ≤10000株 6~10 100株 薯苗 >10000株 3~5 ≤10 000 kg 6~10 100 kg 种薯 >10 000 kg 3~5 注：不足抽样最低数量的全部作为混合样品。 5 检测方法 5.1 硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定(NCM-ELISA)检测法 用于检测SPFMV、SPLV、SPVG、SPCFV和SPCSV共5种病毒，检测方法见附录A。 5.2指示植物检测法 用于辅助检测SPFMV、SPLV、SPVG、SPCFV、SPCSV和Sweepoviruses共6种（类）病毒，检测方 法见附录B。 5.3聚合酶链式反应(PCR)检测法 用于检测Sweepoviruses。检测方法见附录C。 5. 4反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法 用于检测SPCSV。检测方法见附录D。 NY/T 402—2016 6脱毒种薯(苗)的检测程序及质量标准 6.1脱毒组培苗 用NCM-ELISA、PCR、RT-PCR和指示植物法进行检测，检测结果均应为阴性，即带毒率为0。 6. 2 原原种 用NCM-ELISA或指示植物法进行检测，其中10%以上（含）样品分别利用PCR和RT-PCR方法 检测。带毒率为0。 6.3原种 用NCM-ELISA或指示植物进行检测，其中5%以上（含）的样品分别利用PCR和RT-PCR方法检 测。SPFMV、SPLV、SPVG和SPCFV的带毒率<2.0%,SPCSV和Sweepoviruses的带毒率为0,病毒 病显症率≤1. 0%。 6.4生产用种 用NCM-ELISA或指示植物进行检测，其中1%以上（含）的样品分别利用PCR和RT-PCR方法检 测。 SPFMV、SPLV、SPVG和SPCFV的带毒率≤10.0%,SPCSV和Sweepoviruses的带毒率为0，病 毒病显症率<5. 0%。 3 NY/T 402—2016 附录A （规范性附录） 硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法 A.1溶液配制 所用化学试剂为分析纯级规格，用水为无 PUBL A. 1. 11 mol/L Tris-HCI 在300mL无菌蒸馏水中,溶 解 入约32 5mL浓盐酸(HCI)， 调节pH为7.5，定容至 500 在800mL无菌蒸馏 292 C保存 缓冲盐溶液 A. 1. 3Tris-HCL TBS) 1/ LCDri 分别取上述 HCI(pH/7 020mL aCl 100 mI 用无菌蒸馏水定容 至1 L。 0.5mL吐温 -20)溶于 1 L TBS A.1.5抽提缓冲液 0.2g亚硫酸 (Na 溶 TBS 中,将溶液定 至100m A.1.6封闭缓 冲液 g. 立通(Triton)X-100 0. 5 mL 和 TBS 25m 先将脱脂 取脱脂奶粉 容解 星于少量TBS 中,再用 TBS定 261 见配现用 NT A.1.7抗体缓冲 液 取脱脂奶粉1. 容至50mL。 A.1.8底物缓冲液 人 取 Tris 6. 1 g、NaCl g、氯化镁（MgCl2 : 6H00 .5g.溶于400mL蒸馏 ,用浓盐酸调pH至 9.5，定容至500mL。 A.1.9氯化硝基四氮唑蓝(NBT)储备液 取 0. 04 g NBT溶于 1. 2 mL N-二甲基甲酰胺(DMF) 20℃避光保存备用。 A. 1. 105-溴-4-氯-3 -吲哚基-磷酸盐(BCIP)储备液 取0.02gBCIP溶于1.2mLDMF中，一20℃避光保存备用。 A. 1. 11NBT/BCIP底物溶液 先后取100μLNBT储备液和100μLBCIP储备液，加入25mL底物缓冲液中，振摇混匀，现配 现用。 A.2样品制备 将待测叶片用清水清洗干净，从每一样品上中下部的叶片上各取一直径约1cm圆片。放入研钵 中,加人3mL抽提缓冲液充分研磨，将研磨液加人到5mL离心管中，6000r/min，离心2min，取上清 液点膜。 4 NY/T 402—2016 A.3操作步骤 A.3.1点膜 将划好方格(1cmX1cm)的硝化纤维素膜用TBS缓冲液处理后放在洁净的滤纸上，每个样品各吸 取15μL上清液滴在膜上方格的正中，室温干燥15min～30min。同时设阳性、阴性和空白对照。根据 需要设置重复。 A.3.2封闭 将干燥后的膜浸人封闭缓冲液中， .50r/min。 A.3.3与一抗反应 将膜置于用抗体缓冲液稀释至工 作浓度的 特异性抗体溶液中 室温下摇床振荡10h～12h，50 r/min。 A.3.4洗膜 用洗涤缓冲 液洗 床振荡 nin A.3.5 与二 亢反应 用滤纸 将膜 装面的溶 复稀释至 碱性磷酸酶标记的抗体溶 液中，室温 50r/ml A.3.6 洗膜 洗涤 ,方法同 A.3.7 显色 用滤纸将 的溶液吸干将膜置于 NBT 物溶液中，避光 A.3.8 终止 反应