ICS 65.020.01 B 05 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3640—2020 葡萄品种鉴定 SSR分子标记法 Identification of grape cultivars using SSR markers method 2020-07-27发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3640—2020 目 次 前言 1 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 4 原理· 5 仪器设备及试剂 6 溶液配制 7 引物相关信息及使用 8 参照品种及其使用.… 操作程序 10判定方法： 附录A（规范性附录） 主要仪器设备及试剂 附录B(规范性附录) 溶液配制 附录C(规范性附录) 30对引物名单及序列.. 附录D(资料性附录) 引物相关信息 附录E(资料性附录) 参照品种名单及来源 NY/T3640—2020 言 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机树不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部种业管理司提出。 本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院郑州果树研究所、农业农村部科技发展中心。 本标准主要起草人：姜建福、刘崇怀、樊秀彩、张颖、孙海生、卢新、李民、李贝贝、焦健 ⅡI NY/T3640—2020 葡萄品种鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeat，SSR)分子标记法进行葡萄（VitisL.）品种 鉴定的术语和定义、原理、仪器设备及试剂、溶液配制、引物相关信息及使用、参照品种及其使用、操作程序 和判定方法。 本标准适用于葡萄品种的SSR分子标记鉴定 2 规范性引用文件 下列文件对于本 的 注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版 包 所有 的修改单适用 NY/T2563 植物新品种特 A 性和稳定性测试指 NY/T2594 植物品私鉴 EDNNT 3术语和定义 S NY/T2594 界定的以 下列术语和员 A 3. 1 R 核心引物 ore pril 品种鉴定中 优先选用的 套SSR物 具有多态性高重复性好等综 3. 2 扩展引物 xtended 品种鉴定中备 SSR引物， 有重复 3. 3 待测样品 送检单位提供的 4原理 简单重复序列(SSR) 泛分布于葡萄基区 因组中 不同品种间每个SSR 位点重复单位的数量可能不 同。针对每个SSR位点两侧序列高度保守的特点，设计对特异引物，利用PCR（聚合酶链式反应，Poly merasechainreaction)技术对重复序列进行扩增。在电泳过程中，由于SSR位点重复单位的数量不同，经 过扩增产生不同长度的片段，在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。因此， 根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定葡萄品种。 52 仪器设备及试剂 见附录A。 6溶液配制 见附录B。 引物相关信息及使用 引物名单及序列见附录C，引物等位变异等相关信息参见附录D。 NY/T3640—2020 8参照品种及其使用 参照品种的名称及来源参见附录E。在进行待测样品等位变异检测时，应同时包括相应参照品种的 PCR扩增产物的检测。 品种核对，确认无误后使用。 注2：对于附录E中未包括的等位变异，应按本标准方法，通过使用DNA分析仪与参照品种同时进行检测确定其大小。 9操作程序 9.1样品制备 时，进行单独取样分析。 9.2DNA提取 a）称取葡萄幼嫩叶片0.25g，放入一20℃预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨多次，至粉末状后，立即 装2mL离心管中，依次加入1.5mL预热（70℃）的2%CTAB提取缓冲液、45μLβ-疏基乙 醇，充分摇匀。 b）65℃恒温水浴1h，期间每隔10min翻转离心管数次。12000r/min，4℃离心15min。 c）取上清液，加人等体积的氯仿：异戊醇（24：1，V/V)，轻轻颠倒混匀，于常温下静置10min， 12000r/min，4℃离心15min。 d) 取上清液，加人等体积的氯仿，颠倒混匀，12000r/min，4℃离心15min。 r/min，4℃离心10min，弃上清液， f）沉淀的DNA用75%乙醇浸泡清洗沉淀2次，弃乙醇，离心管置于通风橱中风干，将沉淀物溶解 于200μL双蒸水中，加1μL10g/L的RNaseA，37℃温浴30min，一20℃保存备用。 g) 用75%乙醇浸泡清洗沉淀2次，风干，将沉淀物溶解于200L双蒸水中。 h) 利用NanoDrop分光光度计检测DNA浓度，将DNA浓度稀释到50ng/mL左右，一20℃保存 备用。 注：以上为推荐的DNA提取方法，其他达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法均适用。 9.3PCR扩增 9.3.1反应体系 PCR反应体系为20μL:10XBuffer(含Mg2+)2.0μL,2.5mmol/LdNTPs2.0μL，样品DNA2.0 μL，EXTaq酶（5U/μL)0.2μL，正向和反向引物（10mmol/L)各1.0μL，双蒸水11.8μL。 利用毛细管电泳荧光检测时使用荧光标记引物。引物的荧光染料种类参见附录D。 9.3.2反应程序 94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃～58℃（根据附录D推荐的引物退火温度设定）退火30， 72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min；扩增产物4℃保存。 9.4PCR产物检测 9.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE) 9.4.1.1清洗玻璃板 将玻璃板清洗干净，用去离子水冲洗后晾干。用无水乙醇擦洗2遍，吸水纸擦干。在长板上涂上 0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止2块玻璃板互 相污染。 9.4.1.2组装电泳板 待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。 2 NY/T 3640—2020 9.4.1.3制胶 在60mL6%PAGE胶液中分别加人600μL10%的过硫酸铵和60μLTEMED,轻轻混匀后，制胶。 制胶过程中防止出现气泡。待胶液充满玻璃板夹层，将0.4mm厚鲨鱼齿梳齿平齐端向里轻轻插人胶液 约0.4cm。胶液在室温下聚合2h以上。胶聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子，用水清洗 干净备用。 9.4.1.4电泳 清除凝胶顶端气泡和聚丙烯酰胺碎片。每一个加样孔点人2uL～4μL扩增产物和2μL6×Load- ingBuffer，在胶板两侧点人DNAMarker。除待测样品外，还应同时加入参照样品的扩增产物。在30 W~40W恒功率下电泳，使凝胶温度保 保持在约50℃。电泳1.5h~2.0h（电泳时间取决于扩增片段的 大小范围）。 ISH 9.4.1.5银染 RD a) 漂洗：取出胶板，放人水洗篷中，用蒸馏水漂洗 b) 染色：从水洗框中取出胶板放•染色液！ 在摇床 c) 漂洗：取 胶 板，放文水 蒸馏水漂洗一 一次： d) 显影：将 胶板 板放人显影 r/min显影 e) 定影： 将胶板放固定液 漂洗 馏水漂洗胶板10 9.4.1.6银染 检 测与结果记录 将不同待 羊品的每 比较，比较样品间每 同 当条带类型完 全一致时，记录为 相同位 当条带类型不完全 9.4.2荧光标记 毛细管电泳 9.4.2.1 PCR 等体积混 不同荧 电吸取 NQ分析仪专用96孔板孔 中。板中各孔分别 加人0 让分于 太离子甲酰 min，迅速取出置 离心10后上机电泳 位点还应同时包括1个一2个参照样品的扩增 除待测样品外 产物。 注：不同荧光标记的 增了物的最适稀释倍数最好通过毛细管电泳荧光检测预试验确 9.4.2.2电泳检测 按照仪器操作手册 ，编辑样品表 9.4.2.3DNA分析仪检测 通过参照样品消除同型号 不同批次间或不同型号DNA分析仪间 可能存在的系统误差，使用片段分 析软件读取样品在该位点的等位变 示例1：参照样品霞多丽、红地球在VVMD32位点上的等位变异大小分别为238/270和250/270，表D.1中霞多丽、红 地球相应的数据分别为236/268和248/268，系统误差为2。一个待测样品的等位变异大小原始数据为254，则 待测样品在该位点上的等位变异数据应为252。 地球相应的数据分别为186/194和184/186，系统误差为0。一个待测样品的等位变异大小原始数据为224，则 待测样品在该位点上的等位变异数据应为224。 9.4.2.4结果记录 对于二倍体品种，纯合位点的基因型数据记录为X/X，杂合位点的基因型数据记录为X/Y，其中X、Y 分别为该位点上两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后；缺失位点基因型数据记录为0/0。 对于三倍体和四倍体品种，直接记录在该位点上的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后，不同 片段大小用/间隔。 示例1：一个二倍体品种在VrZAG62位点上有1个等位变异，大小为186，则该品种在该位点上的等位变异数据记录 3 NY/T3640—2020 为186/186。 示例2：一个二倍体品种在VVS2位点上有2个等位变异，大小分别为149和153，则该品种在该位点上的等位变异数 据记录为149/153。 示例3：一个四倍体品种在VVMD25位点上显示有3个等位变异，大小分别为238、246和252，则该品种在该位点上的 等位变异数据记录为238/246/252。 10判定方法 10.1结果统计 对检测的位点逐一进行比较，统计总位点数、差异位点数、无差异位点