ICS 65.020.01 B 05 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3639—2020 中华弥猴桃品种鉴定 SSR分子标记法 Identification of Actinidia chinensis cultivars using SsR markers method 2020-07-27发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3639—2020 目 次 前言 范围 规范性引用文件 3 术语和定义 原理· 仪器设备及试剂 6 溶液配制 引物相关信息及使用 参照品种及其使用.. 9操作程序 10判定方法 附录A（规范性附录) 主要仪器设备及试剂 附录B(规范性附录) 溶液配制 附录C(规范性附录) 核心引物名单及序列 附录D(资料性附录) 核心引物相关信息 附录E(资料性附录) 参照品种名单及来源 NY/T3639—2020 本标准由农业农村部种业管理司提出 本标准起草单位：中国农业科学院郑州果树研究所湖北省农业科学院果树茶叶研究所、天津市林业 果树研究所、十堰市经济作物研究所。 本标准主要起草人：方金豹、钟云鹏、齐秀娟、孙雷明、张蕾、林苗苗、刘景超、陈锦永、朱先波、顾红。 II NY/T3639—2020 中华弥猴桃品种鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了利用简单重复序列(SimpleSequenceRepeats，SSR)分子标记进行中华猕猴桃[Actin- idia chinensisPlanchon，包括中华猕猴桃原变种（ActinidiachinensisPlanch.var.chinensis）和美味猕猴 桃变种(Actinidia chinensisPlanch.var.deliciosaAChev ralier)雌性品种鉴定的术语和定义、原理、仪 器设备及试剂、溶液配制、引物相关信息及使用、参照品种及其使用、操作程序和判定方法。 本标准适用于中华猕猴桃雌性品种的SSR分子 2规范性引用文件 下列文件对于本文 日期自 日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本 NY/T2351 植物新品种特异性 致性和稳定性测试指南 猕猴 NY/T2594 植物品种鉴 DNA分子标记法 S 3术语和定义 下列术语和定义适用于 3. 1 R 核心引物 core primers 品种鉴定中优 先选用的 套SSR引物：具有多态性高、重复性好等综合特 3. 2 待测样品 sample 送检单位提供的 4原理 R 艺分布于 简单重复序列（ 华猕猴桃基因组中，不同品种间每个 SSR 重复单位的数量可 能不同。针对每个SSR R（聚合酶链式反应， Polymerasechainreaction）技术对重复序列进行扩增。在电泳过程中，由于SSR 位点重复单位的数量不 同，经过扩增产生不同长度的片段，在电场作用下得到分离经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。 因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定中 猕猴桃品种。 5仪器设备及试剂 见附录A。 6溶液配制 见附录B。 7引物相关信息及使用 引物名单及序列见附录C,引物等位变异等相关信息参见附录D。 8参照品种及其使用 参照品种的名称及来源参见附录E。在进行待测样品等位变异检测时，应同时包括相应参照品种的 1 NY/T3639—2020 PCR扩增产物的检测。 注1：同一名称不同来源的参照品种的某一位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参照品种时，应与原参照 品种核对，确认无误后使用。 注2:对于附录E中未包括的等位变异，应按本标准方法，通过使用DNA分析仪与参照品种同时进行检测确定其大小。 9操作程序 9.1样品制备 果较差时，进行单独取样分析。 9.2DNA提取 a）称取中华猕猴桃幼嫩叶片0.25g，放人一20℃预冷的研钵中，加人液氮迅速研磨多次，至粉末状 后，立即装人2mL离心管中，依次加人1.5mL预热（70℃)的2%CTAB提取缓冲液、45μLβ- 基乙醇，充分摇匀。 b)6 65℃恒温水浴1h，期间每隔10min翻转离心管数次。12000r/min，4℃离心15min。 12000r/min,4℃离心15min。 d）取上清液，加人等体积的氯仿，颠倒混匀，12000r/min，4℃离心15min。 e）取上清液，加人2倍体积一20℃预冷的无水乙醇，颠倒混匀，在一20℃下静置30min；12000 r/min，4℃离心10min，弃上清液。 f) 沉淀的DNA用75%乙醇浸泡清洗沉淀2次，弃乙醇，离心管置于通风橱中风干，将沉淀物溶解 于200μL双蒸水中，加1μL10g/L的RNaseA，37℃温浴30min，一20℃保存备用。 g) 用75%乙醇浸泡清洗沉淀2次，风干，将沉淀物溶解于200μL双蒸水中。 h）利用NanoDrop分光光度计检测DNA浓度，将DNA浓度稀释到50ng/mL左右，一20℃保存备用。 注：以上为推荐的DNA提取方法，其他达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法均适用。 9.3PCR扩增 9.3.1反应体系 PCR反应体系为20uL：10XBuffer（含Mg2+）2.0uL，2.5mmol/LdNTPs2.0uL，样品DNA2.0 μL,EXTaq酶（5U/μL)0.2μL，正向和反向引物（10mmol/L)各1.0μL，双蒸水11.8μL。 利用毛细管电泳荧光检测时使用荧光标记引物。引物的荧光染料种类参见附录D。 9.3.2反应程序 94℃预变性4min；94℃变性30s，54℃~56℃（根据附录D推荐的引物退火温度设定）退火30s， 72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min；扩增产物4℃保存。 9.4PCR产物检测 9.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE) 9.4.1.1清洗玻璃板 将玻璃板清洗干净，用去离子水冲洗后晾干。用无水乙醇擦洗2遍，吸水纸擦干。在长板上涂上0.5 mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止2块玻璃板互相污染， 9.4.1.2组装电泳板 待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。 9.4.1.3制胶 在60mL6%PAGE胶液中分别加人600μL10%的过硫酸铵和60μLTEMED，轻轻混匀后，制胶。 制胶过程中防止出现气泡。待胶液充满玻璃板夹层，将0.4mm厚鲨鱼齿梳齿平齐端向里轻轻插入胶液 约0.4cm。胶液在室温下聚合2h以上。胶聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子，用水清洗 干净备用。 2 NY/T 3639—2020 9.4.1.4电泳 清除凝胶顶端气泡和聚丙烯酰胺碎片。每一个加样孔点人2μL～4μL扩增产物和2μL6×Load- ingBuffer，在胶板两侧点入DNAMarker。除待测样品外，还应同时加人参照样品的扩增产物。在30 W~40W恒功率下电泳，使凝胶温度保持在约50℃。电泳1.5h~2.0h（电泳时间取决于扩增片段的 大小范围）。 注：具体功率大小根据电泳槽的规格型号和实验室室温设定。 9.4.1.5银染 a) 漂洗：取出胶板，放人水洗筐中，用蒸馏水漂洗2次，每次漂洗30s； b) 染色：从水洗框中取出胶板，放人染色液中，在摇床上30r/min染色20min； c) 漂洗：取出胶板，放人水洗框中，用蒸馏水漂洗一次，时间不超过10s； (P 显影：将胶板放人显影液中，在摇床上30r/min e) 定影：待条带清晰后：将胶板放人固定液中定景 f) 漂洗：用蒸馏水 9.4.1.6银染检测与 将不同待测样品的每 增 进行逐一 比较，比 RESE 全一致时，记录为相同位点；平条带类型不完 致时，记录为差 异位点 9. 4.2.1 PCR 产物样品制备 等体积混合 同荧光标记扩增产物混匀后从混合液中吸取工汇加入 用96孔板孔 中。板中各孔分别 加人 江分子 量内标和9 将样品 95℃变性5 min,迅速取出 冷却10mm离心10s后上机电泳。 除待测样 每个SSR位 点还应回时包括1个， 2个参照样品的护增 注：不同荧光标 的广增产 圣倍数晨好通过毛细管电泳荧光检测预试验确定 ICEN 9.4.2.2电泳检测 按照仪器操作 编辑样品表，执行运行程，保存数据 9.4.2.3DNA分析 义 检测 通过参照样品 除同型 同批次 间或不同型号DNA分 误差，使用片段分 析软件读取样品在该 点的筹位 变异 T 示例1：参照样品红阳 409点 注的等位变异 和12081 红阳、素香相应的数据 分别为110和1N18， 系统误差头 个待测样品的等位变异大小原始数据为128 川待测样品在该位点上的等 位变异数据应为12 示例2：参照样品布鲁诺、桂海 在UDK971 点上的等位变异大小分别为 和138，表D.1中布鲁诺、桂海4 号相应的数据分别为116和138,系统误差为0。一个待测样品的等 异大小原始数据为124，则待测样品在 该位点上的等位变异数据应为1 9.4.2.4结果记录 对于二倍体品种，纯合位点的基因型数据记录为X/X，杂合位点的基因型数据记录为X/Y,其中X、Y 分别为该位点上两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后；缺失位点基因型数据记录为0/0。 对于四倍体和六倍体品种，直接记录在该位点上的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后，不同 片段大小用“/"间隔。 示例1：一个二倍体品种在UDK96-001位点上有1个等位变异，大小为285，则该品种在该位点上的等位变异数据记录 为285/285。 示例2：一个四倍体