ICS 65.020.01 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3631—2020 茶叶中可可碱和茶碱含量的测定 高效液相色谱法 Determination of theobromine and theophylline in tea- High performance-liquid chromatography 2020-07-27发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3631—2020 食典通 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院茶叶研究所、农业农村部茶叶质量监督检验测试中心。 本标准主要起草人：刘新、蒋迎、周苏娟、汪庆华、马桂岑、陈利燕、张颖彬。 一 NY/T3631—2020 茶叶中可可碱和茶碱含量的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了茶叶中可可碱、茶碱含量的高效液相色谱测定法。 本标准适用于茶叶中可可碱、茶碱含量的测定。 本方法可可碱的定量限为3.2mg/kg，茶碱的定量限为4.4mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的P凡是期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 HING GB/T8303 磨碎试样的制备及其干物质 3原理 RE 茶叶试样中的可 可碱和茶 碱用70℃热永提取：经净化，过滤是容.Cm 谱柱 第度洗脱分离， 271nm波长处测定 外标法 4 JRA 试剂和材料 除非另有说明 用试剂为分析纯。水 4. 1 乙腈(C² CAS 4. 2 甲醇(CH 4.3 甲酸（CH） 4.4 氢氧化钠（ AS:1310-73-2 4.5重质氧化镁 即灯重 析纯氧化镁经900℃灼烧30mm 化镁，储存于干 燥器中。 R Ds 4.6可可碱(C,HsN -67-0 纯度 ≥98 4.7 茶碱(CHNO2 58 4.8液相流动相B:取5 甲酸（4.3 用水定容至 4.9标准储备溶液（1000mg 分别称取可节 gc精确至0 1g）)、茶碱（4.7)0.1g（精确 至0.0001g），用甲醇（4.2)分别定容 至100mL(其中可可碱标准物质可先用少量2g/L的NaOH溶液溶 解）。配制好的1000mg/L的标准储备液储存了 -18℃冰箱，储存期6个月。 μL、2μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL茶碱的标准储备溶液（4.9)用水或初始流动相稀释并定容至 10mL，得到一系列标准工作液（质量浓度分别为可可碱1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50 mg/L、100mg/L,和茶碱0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L),0℃~ 5℃保存，保存期1个月。 4.11微孔滤膜：孔径0.45μm，水相。 5仪器设备 5.1高效液相色谱仪：配备紫外或二极管阵列检测器。 5.2分析天平：感量0.0001g和0.001g。 1 NY/T3631—2020 5.3恒温水浴锅：控温精度土1℃。 5.4离心机：≥4000r/min。 5.5离心管：容量50mL。 5.6 容量瓶：容量25mL。 6 试样制备 茶叶样品按GB/T8303规定制备并测定干物质含量。 7分析步骤 7.1提取 称取0.5g（精确至0.0001g）茶叶试样于50mL离心管（5.5)中，加入1.0g重质氧化镁（MgO)。加 人15mL70℃水后，置于70℃水浴中，期间不时振荡以保证料液充分接触，浸提10min，冷却至室温， 次。合并两次提取的上清液，冷却至室温，用水定容至25mL。提取液经0.45μm水系滤膜过滤，供高效 液相色谱检测。 7.2测定 7. 2. 1 仪器参考条件 a) 色谱分析柱：C1反相色谱柱，4.6mmX250mm，5μm。 b) 色谱柱温度：40℃。 c) 检测波长：271nm。 d) 进样体积：20μL。 e) 流动相：乙睛（4.1)和流动相B(4.8），流速及梯度洗脱条件见表1。 f) 流速：1mL/min。 表1林 梯度洗脱条件 流动相,% 时间，min 乙腈 流动相B 0 6. 5 93.5 12 13 87 12.1 25 75 20 25 75 20.1 6.5 93.5 30 6. 5 93.5 7.2.2标准曲线的绘制 将系列混合标准工作液注入高效液相色谱仪，按7.2.1进行色谱分析，以峰面积为纵坐标、浓度为横 坐标作标准曲线，得到线性回归方程。标准溶液色谱图参见附录A的图A.1。 则应稀释后再进样分析，外标法定量。 8 结果计算 茶叶试样中可可碱或茶碱按式(1)计算。 cXV (1) mXw 式中： X 试样中可可碱或茶碱的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； 2 NY/T3631—2020 进样液中可可碱或茶碱的浓度，按照外标法，从标准曲线中求得浓度，单位为毫克每升（mg/ L); 茶叶试样称样质量，单位为克（g）； W一一茶叶试样的干物质含量（质量分数），单位为百分号（%）； V一一试样提取体积，单位为毫升（mL）。 测定结果以2次测定的算术平均值表示，测定结果小数点后位数的保留与方法检出限一致，最多保留 3位有效数字。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立的测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的10%。 在再现性条件下获得的两次独立的测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的15%。 3 NY/T3631—2020 附录A (资料性附录） 可可碱和茶碱的液相色谱图 可可碱、茶碱标准溶液的液相色谱（入=271nm）见图A.1。 响应值，μm 0.045 0.040 可可碱 0.030 0.025 0.015 0.010 S00'0 000'0 0.005 t,min 01.002.003.004.005.00 9:0010.0011.00 0014.0015.0016.0017.0018.00 .0020.0021:002 7.0028.0029.0030.00 图A1 可可碱、 NY/T 3631-2020 全国农业食品标准 公共服务平台 中华人 茶叶中可可碱和茶碱含量的测定 高效液相色谱法 NY/T3631—2020 * * * 中国农业出版社出版 (北京市朝阳区麦子店街18号楼） （邮政编码：100125 网址：www.ccap.com.cn) 北京印刷一厂印刷 新华书店北京发行所发行 各地新华书店经销 * * * 开本880mm×1230mm1/16 印张0.75 字数15千字 2020年10月第1版 2020年10月北京第1次印刷 书号：16109·8224 定价：18.00元 版权专有 侵权必究 NY/T3631-2020 举报电话：（010）59194261