ICS 65.020.20 B 05 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3622—2020 马铃薯抗马铃薯Y病毒病鉴定技术规程 Technical code of practice for evaluation of potato resistance to Potato virus Y 2020-07-27发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 3发布 NY/T 3622—2020 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准起草单位：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。 本标准主要起草人：杨宇红、范振川、谢丙炎、凌键、李彦、徐东辉。 I NY/T3622—2020 马铃薯抗马铃薯Y病毒病鉴定技术规程 1范围 本标准规定了马铃薯抗马铃薯Y病毒病(PotatovirusY,PVY)鉴定方法与评价标准。 评价。 2规范性引用文件 件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件.其最新版本包括所有的 GB/T36816 马铃薯Y病毒检疫鉴定方法 NY/T1858.6 番茄抗番茄花叶病 SN/T1840 植物病毒免疫电镜检测方法 3术语和定义 S NY/T 1858. 界定的以 及下列术语和定义适用于 3. 1 A 马铃薯Y 由马铃薯 马铃薯引起的植株表现重型花叶叶脉坏死和垂叶条 等症状的病毒性病 害。病害症状及病 CENTE 4试剂与材料 除非另有说明 本方法所用试剂均为分析纯或生化试剂 4. 1 0. 03 mol/1 磷酸盐缓冲液（PBS)(pII.0) 先分别配制A 液和液 用B液调配A液至pH7.0即可 A液为0.03mol 磷酸氢 HPO )液·称取10.74gNa,HPO 容于1L无离子水 中，摇匀。 人 B液为0.03mol/L磷酸二氢钾（KHI,PO)液称取4.08gKHPO.溶于 无离子水中，摇匀。 4.2感病对照品种 从下列感病品种中选择1 2个作为感病对照：合作88、丽薯6 米拉、男爵或夏坡地（Shepo- dy)。 4.3PVY繁殖寄主 以黄苗榆烟（Nicotianatabacumcv.Huangmiaoyu）、珊西烟（N.tabacumcv.Xanthi-NC）、三生烟 (N.tabacumcv.Samsum）或心叶烟(N.glutinosa）为PVY繁殖寄主。 4.4育苗基质 直接购买商品化蔬菜育苗基质，或将草炭、蛭石和菜田土按体积2：1：1混合均匀，于（134土1)℃湿 热灭菌1h。 4.5其他用品 600目金刚砂、硅胶、氯化钙（CaCl2）等 5抗病性鉴定 5.1材料育苗 1 NY/T3622—2020 将供鉴定的脱毒健康种薯置于15℃～20℃下催芽。待薯芽长为1cm～1.5cm时，播种于装有育苗 基质的育苗钵内，每钵播种1个小薯；也可将无毒组培苗种于育苗钵中。置于防虫日光温室里育苗，温度 保持在21℃～25℃，常规水肥管理，自然光照。 5.2接种体制备 5.2.1病毒分离、纯化 马铃薯Y病毒的分离、纯化与保存见附录B。 5.2.2接种体繁殖、制备 针对育种目的，选择PVY对应株系或混合株系作为接种毒源，PVY株系鉴定按照GB/T36816的规 定执行。取少量马铃薯Y病毒供试株系的冻干叶或在繁殖寄主上保存的病叶，加少量PBS缓冲液在碾钵 中碾碎，人工摩擦接种在PVY繁殖寄主幼苗的叶片上，置25℃～28℃的防虫温室内培养约2周后采收病 叶。1g鲜病叶加10mL的0.03mol/LPBS缓冲液（pH7.0），研磨后双层纱布过滤或3000r/min离心 15min，其滤液或上清液即为接种悬浮液，用于人工接种。 5.3接种 5.3.1接种时期 幼苗生长至4叶6叶期。 5.3.2接种浓度 病叶/PBS缓冲液（pH7.0)为1/10（/V），配制方法同5.2.2。 5.3.3接种方法 接种前1d给植株浇足水分，并将马铃薯幼苗黑暗处理24h。接种方法主要有以下2种： a) 摩擦接种法：接种前用肥皂将手洗净，选取植株上部3片复叶的顶叶，在叶面上均匀撒布1薄层 600目金刚砂，然后用一只手掌托起叶片，另一只手用手指蘸取病毒接种悬浮液沿叶脉按顺序轻 轻摩擦接种，用力程度以接种叶片表面无严重损伤为度。该方法宜用于少量材料鉴定。 b）喷枪接种法：将混有金钢砂的马铃薯Y病毒接种悬浮液用喷雾枪距植株5cm左右处喷射接种， 接种时喷雾枪压力为1.5kg/cm²～2kg/cm²。该方法宜用于大量材料鉴定。 接种后，用洗瓶轻轻冲洗接种叶片表面的残留物。3d～5d后重复接种1次 鉴定材料随机排列，每份材料设3个重复，每重复不少于10株苗。 5.3.4接种后管理 接种后置于白天温度24℃30℃、夜间不低于20℃的防虫日光温室里培养，常规光照，正常栽培 管理。 6病情调查 6.1调查方法 接种后25d～30d调查每份鉴定材料接种株发病情况，根据表1中的病害症状描述，逐份材料逐株进 行调查，记载接种株病情级别，按式(1)计算病情指数(DiseaseIndex，DI)。 6.2病情级别划分 植株病情分级及其对应的症状描述见表1。 表1马铃薯抗马铃薯Y病毒病接种鉴定的病情级别划分 病情级别 症状描述 0 无任何症状 1 心叶明脉或轻花叶 3 上部叶片轻花叶，个别叶脉或叶柄或茎上产生坏死 5 上中部叶片重花叶，少数叶脉、叶柄或茎产生坏死；个别叶片变小、变脆并皱缩 7 多数叶片重花叶，部分叶脉、叶柄或茎产生较多坏死斑；少数叶片变小、变脆并皱缩或落叶，植株稍矮化 9 多数叶片重花叶、变小、变脆并皱缩，叶柄或茎部出现黑褐色坏死条斑，或植株明显矮化、落叶，甚至死亡 2 NY/T3622—2020 6.3病情指数计算 病情指数(DI)按式(1)计算。 (s Xn) DI : X100 NXS 式中： 各病情级别数值与相对应的各病情级别植株数乘积的总和； s 各病情级别数值； n 各病情级别的病株数，单位为株； N 调查的总株数，单位为株； 病情级别的最高数值。 7抗病性评价 7.1抗性评价标准 抗性划分标准见表2。 表2 马铃薯抗马铃薯Y病毒病的评价标准 病情指数(DI) 抗性评价 DI=0 免疫(I) >>0 高抗(HR) 5<DI≤20 抗病(R) 20<DI≤35 中抗(MR) 35<DI≤60 感病(S) DI>60 高感(HS) 7.2鉴定有效性判别 当感病对照材料达到其相应感病程度（DI>35），该批次鉴定结果视为有效。 7.3抗性判断 依据鉴定材料3个重复的平均病情指数（DI)确定其抗性水平，写出正式鉴定报告，并附原始记录（鉴 定结果记录见附录C)。 8 鉴定材料处理 鉴定完毕后，将马铃薯发病植株、残体集中进行无害化处理，用于鉴定的育苗基质采用高温灭菌。 3 NY/T3622—2020 附录A （资料性附录） 马铃薯Y病毒及株系 A.1症状描述 植株被PVY侵染后，主要表现重型花叶、叶脉坏死和垂叶条斑坏死等症状，随感染PVY的株系、栽 培品种、天气状况和感染类型的不同而各异 般植株感病初期：叶片呈现花叶、皱缩，小叶叶缘向下卷 曲，叶片有坏死斑点，或病叶背面叶脉坏死の严 严虽时，叶病及芝部均有黑褐色坏死条斑、质脆易折，叶片干 枯但基本不脱落，挂于坏 不死。 TAND X A.2学名和主要性状 A.2.1学名 YPVY属于 FPotyvi 碧 丫病毒属（Poty- S virus)。 A.2.2主要性状 PVY粒体为 曲的线 我条状粒体，无包膜长680nm 本螺旋对称结 构，螺距3.4nm， Df(3 39）×10，颗粒含有约5%的核酸和95%的蛋白 汇 因组为正义单 链RNA，大小 kb11kb。在CsCl中浮力密度为1.31g/cm² 致死温 2C，稀释限点 10-3~10-2，体外 PVY寄主范 较广，能侵染茄科多种植物。 20多种有翅 蚜以非持久性方式 专播无潜育期蚜虫持毒时间不超过 不能跨龄期传毒 嫁 也可传毒，块 茎可能带毒，部分寄 主作物中 以通过种了传播。 马铃薯生 过带毒种苗种薯 传播。 A.3PVY株系分化 DeBokx等将PVY划分为3 株系PVYO普通株系）引起马 系统性花叶、卷曲、叶 和茎的坏死等症状;PVY （脉坏死株系）几乎在所有的马铃薯栽培品种上 起轻度的斑驳，但却造 成烟草严重的系统性脉坏死， PVYC（点刻条斑株系）在许多含有Nc基因的马铃薯品种上产生过敏性 坏死反应，在另一些品种上造成系统花叶。我国主要发生的是PVYN株系与PVYO株系。近年来，一些新 的变异或重组株系陆续地被鉴定，如PVY OIZYEPIY 4 NY/T3622—2020 附录B （规范性附录） 病毒分离、纯化 B.1PVY分离、纯化 在马铃薯Y病毒（PVY)发生期，采集疑似感染马铃薯Y病毒的马铃薯叶片，采用汁液磨擦法接种在 PVY的特定分离寄主色藜（Chenopodiumamaranticolor）的叶片上，1o多d后，待苋色藜接种叶上出 现具红褐色边缘的局部枯斑时，取新鲜枯斑连续3次在苋色藜叶片上进行单斑转移接种以纯化病原物，并 将纯化的病原物分别接种到珊西烟或黄苗榆烟幼苗的叶片上进行繁殖，再用血清学检测、电子显微镜观察 病毒粒子形态及RT-PCR等方法对纯化病原物进行鉴定，鉴定方法按GB/T36816和SN/T1840的规定 执行，确定为马铃薯Y病毒分离物后，最后经柯赫氏法则（Koch'sRule）验证，保存备用。 B.2毒源保存 纯化后的毒源可常年保存在PVY繁殖寄主上，植株置于无虫、温度20℃～28℃、自然光照的防虫温 室内；也可将分离鉴定的PVY毒株接种到易感马铃薯品种的无病毒组培苗上，在7℃～8℃低温