ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3278.1—2018 微生物农药 环境增殖试验准则 第1部分：土壤 Environmental reproduction test guidelines for microbial pesticides- Part 1 :Soil 2018-07-27 发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部‧发布 NY/T 3278. 1—2018 前言 NY/T3278《微生物农药环境增殖试验准则》,分为3个部分： 第1部分：土壤； —第2部分：水； 一第3部分：植物叶面。 本部分为NY/T3278的第1部分， 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本部分起草单位：农业农村部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。 本部分主要起草人：卜元卿、周欣欣、单正军、朱昱璇、袁善奎、姜辉、张燕宁、张兰。 I NY/T 3278. 1—2018 微生物农药 环境增殖试验准则 第1部分：土壤 1范围 本部分规定了微生物农药在土壤中增殖试 粒的材料、条 件、试验操作、数据处理、质量控制、试验报 告等的基本要求。 Ar 2 规范性引用文件 下列文件对于 文 件的应用 少的。 凡是注日期的弓 升用文 仅准日 期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的弓 引用文件 其最新版本（包括所有的修改单适用手本 GB 7172 土壤 水分测定 GB 15618 壤环境厂 量标准 RA 3 术语和定义 下列术语和定 义适用 3. 1 微生物农药 micrdbial pesticide 以细菌、真菌 病毒和 动物或基 因修饰的微生 鼠等有害生物作用 RIC 3. 2 供试物 test subst 3. 3 菌落形成单位 colony forming units,CFL 由单个菌体或聚集成团的多 个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成 3. 4 细菌芽孢 bacterial spore 某些细菌在其生长发育后期,在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休 眠体。 3. 5 真菌孢子fungal spore 真菌的主要繁殖器官。分为有性孢子和无性孢子两大类。孢子在适宜条件下发芽，形成菌丝而进 行分裂繁殖；当外界环境不适宜时，可以呈休眠状态长时间生存。 3. 6 细菌孢囊 bacterialcyst 某些细菌尤其是一些固氮菌在外界缺乏营养的条件下,由整个营养细胞外壁加厚、细胞失水而形成 的一种抗干旱但不抗热的圆形休眠体。 1 NY/T 3278. 1—2018 3. 7 原生动物孢囊protozoan cyst 某些原生动物在外界环境不利条件下,形成的能高度抵抗干旱、冰冻和高温的休眠体。 3.8 细菌营养体vegetativebacterium 单个活的生物体,通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。 3. 9 原生动物protozoa 最原始、最低等的单细胞动物。原生动物除了具有真核细胞的一般特征（具细胞膜、细胞核和细胞 质等)外,其细胞本身是一独立完整的有机体，通过细胞内和细胞表面的一些特殊细胞器来完成运动、营 养和生殖等生命活动。 3. 10 宿存 survival 具有活性的微生物在施用后的一段时间内可在动物、土壤或植物内体或表面保持活性的状态。 3. 11 增殖multiplication 微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生 命个体数量增加的生物学过程。 3. 12 延滞期 lag phase 少量微生物接种到新鲜培养基后,在开始培养的一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，微生 物数目没有增加的一段时期。 3. 13 指数期 log phase 在生长曲线中，紧接着延滞期的一段微生物数量以儿何级增长的时期。 3.14 稳定期 月 stationary phase 新增殖的微生物数量与衰亡的微生物数量相等的时期,这个时期的菌体数量达到最高。 3. 15 亡期deathphase 微生物的个体死亡速度超过新增殖速度，整个群体呈现负生长状态的时期。 4试验概述 将供试物接种到无菌土壤中，在适宜的条件下培养，定时取样测定其数量，得到供试物在土壤中的 动态变化。 5试验方法 5.1材料和条件 5.1.1试验用土 推荐黑土作为试验用土，或采用供试物拟施用地区土壤作为试验用土，试验用土满足GB15618二 级标准的要求。取土壤表面以下0cm～20cm的新鲜土样，封口带回实验室，除去粗大枝叶、动物躯壳 等，风干保藏。风干土壤含水量测定按照GB7172的规定执行。风干土壤研磨过0.42mm筛，用自来 2 NY/T 3278. 1—2018 水调节土壤含水量为最大田间持水量的40%～60%。然后每份100g分装人500mL锥形瓶，至少8 份,121℃灭菌25min～30min。 5.1.2供试物 5.1.2.1类型 供试物包括微生物农药母药、制剂产品。 5.1.2.2批次 试验中供试物应采用同一批次的产品 5.1.3主要仪器设备 超净工作台。 灭菌锅。 显微镜。 分光光度计。 荧光定量PCR 温度计。 天平。 5.2试验操作 5.2.1处理组和对 5.2.1.1处理组 设置供试 5.2.1.2对照组 工 设置培养 白对照 置4个 重复 5.2.2接种量 U C 接种浓度为 ，若供试物因 不能达到 CFU/m 可以根据推荐 使用量计算菌株接种 浓度 接种量 mL浓度 :0 L的菌液。 R 5.2.3接种与培养 在超净工作台内 人火菌 半使供试 土壤充分混合均 匀，封口膜封口后放入培养箱培养 供试物按照其最佳生长条件设立培 养温度 湿度、氧气、光照等培养 参数。 5.2.4取样与存放 自接菌后第 1d开始取样,前 4 d每天取样,取样前搅拌均匀,每次 取 4组样品各1.0g，进行计数测 试。4d后，每隔1d取一次样品。每次取样直 称重，用平 天质量与上次取样后质量差量为失水量，无 菌水补充失水量。试验期间,维持土壤含水量为最大田间持水量的40%～60%。取样量和取样间隔时 间可根据供试物的生长情况调整。样品4℃保存。 5.2.5计数方法 5.2.5.1细菌、放线菌、真菌、酵母 以CFU为计数单位，可采用稀释平板菌落计数法（参见附录A）、绿色荧光蛋白基因标记-平板计数 法(参见附录B)测定。 以基因拷贝数为计数单位,可采用分子标记-荧光定量 PCR法(参见附录 C)测定。 5.2.5.2原生动物、真菌孢子、酵母 以个体数目为计数单位，可采用直接计数法(参见附录D)等测定。 5.2.6试验周期 3 NY/T 3278. 1—2018 试验持续时间应能够反映供试物的延滞期、指数期、稳定期和衰亡期；或在28d内持续检测确认供 试物含量维持稳定或显著低于接种量，则可结束试验。 5.2.7生长-消亡曲线 以培养时间为横坐标、以供试物含量的对数为纵坐标做图,绘出供试物的生长-消亡曲线。 5.3数据处理 5.3.1独立样本t检验 2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式(1)计算。 X,-X, .(1) 2, +o2, n-l 式中： Xi,X, 分别为两样本平均数； 分别为两样本方差； n 样本容量。 5.3.2单因子方差分析(One-Way ANOVA) 3组及以上均值比较时可进行方差分析。单因子方差分析LSD检验按式(2)计算。 LSD。 = ta(df,)S--; (2) 式中: ta(df.) 在F检验中误差自由度下,显著水平为α的临界t值； St,-, 均数差异标准误,按式(3)计算。 Ss-号 = V2MS./n (3) 式中： MS. F检验中误差均方； 各处理重复数。 5.4质量控制 第Od时灭菌土壤不得检出微生物活菌。 使用荧光定量PCR法计数微生物数量时,扩增效率的范围应为90%～110%。 6试验报告 试验报告应至少包括下列内容： a）试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号； b) 试验委托单位和联系方式、样品受理日期和封样情况； 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期； d) 供试物基本信息（如含量和组成信息，以及任何改变供试物生物活性物质的含量和组成信息、 施用量、施用方法等)； 试验系统的详细描述； （ 试验条件，包括试验土壤含水量、pH、有机质含量、温度、光照等； 试验结果，绘制供试物的生长-消亡曲线。 4 NY/T 3278. 1—2018 附录A （资料性附录） 稀释平板菌落计数法 A.1方法原理 由单个细胞生长并繁殖成一个菌 落,根据形成的菌落数来讠 AY A.2试剂 A.2.1 蛋白陈。 A.2.2牛肉膏 A.2.3 可溶性 羊粉 URAL A.2. 4 酵母膏 A. 2.5 麦芽氵 A.2. 6 葡萄糖 A. 2.7 硝酸铂 A.2.8 氯化钠 A. 2. 9 磷酸 A. 2. 10 磷酸氢 A. 2. 11 七水硫 A. 2. 12 七水硫酸 业 A. 2. 13 吐温80。 A. 2. 14 孟加拉红。 A. 2. 15 氯霉素。 A. 2. 16 氢氧化钠溶液：1mo A. 2. 17 盐酸溶液：1mol/L。 A. 2. 18 琼脂。 注：以上化学试剂均为分析纯。 A.3仪器设备 A.3.1高压蒸汽灭菌锅。 A.3.2恒温培养箱。 A.3.3超净工作台。 A.3.4酸度计等。 5