ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 32742018 化学农药 穗状狐尾藻毒性试验准则 Chemical pesticide-Guideline for Myriophyllum spicatum toxicity test 2018-07-27 发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3274—2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本文件技术内容参考了经济合作与发展组织（OECD/OCDE)化学品测试导则No.239《水-沉积物 穗状狐尾藻毒性试验》。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：农业农村部农药检定所。 本标准主要起草人：黄健、周欣欣、张燕、宗兆飞、翟唯钢、袁善奎、杨亚哲、赵雅丽。 I NY/T 3274—2018 化学农药 穗状狐尾藻毒性试验准则 1范围 本标准规定了穗状狐尾藻毒性试验的材料与条件、试验操作、数据分析、质量控制、试验报告等的基 本要求。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 3273难处理农药水生生物毒性试验指南 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3. 1 水-沉积物系统water-sediment system 在实验室应用水相培养基和人工土建立水-沉积物试验系统，用于模拟穗状狐尾藻在野外的生长 情况。 3. 2 测量变量measurement variable 在试验过程中被测量或被记录的变量。本标准中测量变量指穗状狐尾藻的茎、根、整株植物的长 度、鲜重和干重。 3. 3 响应变量response variable 又称因变量，随测量变量的变化而变化。本标准中响应变量指穗状狐尾藻的平均比生长率和生物 量增长量。 3. 4 平均比生长率average specific growth rate 试验期间穗状狐尾藻测量变量的对数增长率，用μ表示。 3. 5 生物量增长量yield 试验期间穗状狐尾藻的茎、根、整株植物的长度、鲜重和干重的变化，即一定试验周期内(如14d)最 终测量值与最初测量值之差 3. 6 半效应浓度median effective concentration 在生长抑制试验中，使供试生物平均比生长率或者生物量增长量比对照下降50%时的供试物浓 度，用ECso表示。在穗状狐尾藻毒性试验中，通过平均比生长率的抑制百分率计算而得的半效应浓度， 用E,Cso表示；通过生物量增长量的抑制百分率计算而得到的半效应浓度，用E,Cso表示。 注：单位为毫克有效成分每升(mg a.i./L)。 NY/T 3274—2018 3.7 抑制百分率percentage inhibition 一定时间内处理组响应变量和对照组的差值，占对照组的百分比。 4试验概述 通过配制水相培养基和人工土建立标准的水-沉积物试验系统用于穗状狐尾藻毒性试验。将供试 物按等比配制一系列不同浓度的试验药液，通过水相染毒法对预培养好的穗状狐尾藻进行染毒，连续培 养14d观察穗状狐尾藻的生长抑制情况。分别测定穗状狐尾藻的茎、根、整株植物的长度、鲜重和干 重，并求出半效应浓度E,C5o（14d)和E，C50（14d)值及其95%置信限，评价供试物对穗状狐尾藻可能产 生的影响。 5试验方法 5.1材料和条件 5.1.1供试生物 穗状狐尾藻（Myriophyllumspicatum）是双子叶植物、狐尾藻属多年生沉水植物，具体描述参见附 录A。试验用穗状狐尾藻应选择同一种群、同一培养批次、健康的、处于快速生长期、生长完好、没有损 伤或者变色的藻。 试验用穗状狐尾藻可引自野外、水产市场或其他实验室。如果来自野外或水产市场，试验开始前将 采集的穗状狐尾藻用与试验相同的水相培养基至少培养8周；采集地点应选择没有受到明显污染的水 域；如果穗状狐尾藻来自其他的实验室，试验前应至少培养3周。穗状狐尾藻的预培养应使用与正式试 验相同的培养基。 5.1.2供试物 农药原药或制剂。对于难溶于水的农药，可用少量对供试生物毒性较小的有机溶剂、乳化剂或分散 剂助溶，用量不得超过100mg/L（或0.1mL/L）。 5.1.3主要仪器设备 人工气候室。 培养箱。 无菌操作台。 电子天平(0.0001g)。 电热鼓风干燥箱。 pH计。 溶解氧测定仪。 温湿度记录仪。 照度计。 植物生长灯。 玻璃烧杯（推荐规格：2L,高约24cm，直径11cm)。 玻璃缸（推荐规格：长约50cm，宽30cm，高40cm）。 培养钵（应选择不易吸附供试物的惰性材料，推荐规格：500mL，高约9cm，直径8cm）。 其他玻璃器皿等。 5.1.4试验条件 光源宜采用连续的植物生长灯（波长范围400nm～700nm），水面上光强120μE/（m²·s）～160 μE/（m²·s)或者8800lx～11800lx，试验区域光照强度差异应保持在土15%范围内，光照/黑暗时间 2 NY/T 3274—2018 比为16h：8h。试验水温应控制在(20士2)℃范围内。植物生长的最佳pH应在7.5～8.0。在试验过 程中，对照组的pH变化不得超过1.5个单位。 5.2试验操作 5.2.1试验体系建立 推荐采用 Smart and Barko水相培养基和人工土建立标准的水-沉积物试验系统,用于穗状狐尾藻 的培养和试验。水相培养基配方和人工土配方见附录B。人工土按照以下顺序装入培养钵：在培养钵 底部铺一张湿滤纸，依次加人约1cm厚的标准土（无营养盐的人工土）、约4cm厚含氮磷营养盐的人工 土和1cm厚的标准土，最后覆盖一层约1cm厚的细沙。沉积物至少填充培养钵容积的70%。 5.2.2预培养 选择同一批次、健康的穗状狐尾藻,截取约 6 cm顶芽,并将底部约3cm去掉侧枝后插人沉积物中。 Smart and Barko培养液至少高出沉积物表面约 10 cm,保证穗状狐尾藻茎叶浸没在培养液中。预培养 过程中随时补充去离子水,使溶液变化量不超过10 少3株移除植株的 银部， 来判断穗状狐尾藻的生长 育情况 良 好： 可以进行试验；如 根部生长不明显 需 要适当延 养时间。预培养结束后 使每 个培养钵中保留3 株生长状态良好 且相似的穗状 狐尾藻 5.2.3方法的选择 S S 根据供试物 性选择 态法或半静态法进行试验 兰静态法时， 的日 十间间隔（如试 验的第7d)更 换 验药液 换液过程中应尽量减少 沉积物悬 当使用静 态法 时，应确保试 验期间的试验药 物浓度不 始浓度的8 过程中女 液出现大量藻 类、细菌等微生牧 试验的正常进行，应选择半静 5.2.4水相染毒 用 Smart 系列不同浓度的试验药液 试验的2L玻璃 烧杯中。将预培 养好的和 至少 几积物表面约 10 cm。 EN 5.2.5预试验 在正式试验 交大的间距设置若干组法 的浓度范围。保 证每个培养钵3株穗 狐尾酒 柒鹤 验容器在培养箱或 人工气候室中应随机 程中随 充去离子水，使溶液 变化量不超过10%。 5.2.6正式试验 在预试验确定的浓度范围,按小于3.2倍的比例间距设置5个~ 浓度组，并设1个空白对照组， 使用助溶剂的还应增设溶剂对照组 白对照组和溶剂对照组分别设置6个重复，处理组设置4个重 复,按5.2.4的方法进行染毒。试验周期为14 d。 5.2.7限度试验 当预试验结果表明供试物在100 mg a.i/L浓度或最大溶解度时没有毒性效应，可直接进行限度试 验。限度试验时,对照组和处理组至少分别设置6个重复,且应对处理组和对照组进行差异显著性分析 (如t检验）。 5.2.8观测与记录 5.2.8.1观测指标和频率 穗状狐尾藻在含有供试物的水体中暴露14d。在试验第0d,从备选穗状狐尾藻中随机选择5盆， 分别测定穗状狐尾藻的茎、根、整株植物的长度、鲜重和干重。在试验第14d,测定每个培养钵中穗状狐 3 NY/T 3274—2018 尾藻的茎、根、整株植物的长度、鲜重和干重。在第0d、第7d和第14d测定pH、溶解氧、试验溶液表面 光强，并观察记录植物生长状况（变色、坏死、萎缩等）；每天测定水温；如果选择半静态法，在更换试验药 液前后测定水温、pH、溶解氧。 5.2.8.2测定方法 穗状狐尾藻的茎、根、整株植物的长度为每个重复3株植物的平均值；植株鲜重和植株干重为每个 重复3株植物重量的总和，并对植株总体生长状态进行观察。茎长、根长、植株总长、鲜重和干重可按下 列方法测定： a）茎长：测定沉积物界面以上，水中穗状狐尾藻的茎长，包括主茎长和侧枝的长度。 b）根长：将穗状狐尾藻轻轻从沉积物中拔出，测量根垂直从上到下的长度 c） 植株总长：茎长和根长的总和。 d）茎、根和整株植物的鲜重：轻轻地将穗状狐尾藻从培养钵中取出，包括根部,洗去泥沙。如果有 断裂的根部在泥土中,将断裂的根部一同取出,并洗净。将植物放在吸水纸上吸干植物的多余 水分，分别测量茎、根和整株植物的鲜重。 e）茎、根和整株植物的干重：鲜重测定结束后,将整株穗状狐尾藻放在电热鼓风干燥箱中，60℃烘 干至恒重，分别测量茎、根和整株植物的干重（精度精确到0.1mg）。 5.2.8.3植株生长状况评价 记录植物外观及水相培养基状况，关注植物发生变色、坏死、萎缩等现象；细菌滋生或藻类污染；生 长状态异常，如发育不良、节间距变化、茎/叶扭曲、侧枝增殖