ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3195—2018 热带作物种质资源抗病虫鉴定技术规程 橡胶树棒孢霉落叶病 Technical code of practice for resistance identification to diseases and insects of tropical crops germpalsm- Corynespora leaf fall disease of rubber tree 2018-03-15 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 3195—2018 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。 本标准由农业部农垦局提出。 本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。 本标准主要起草人：黄贵修、刘先宝、李博勋、时涛、李超萍、蔡吉苗、陈奕鹏、杨扬。 NY/T 3195—2018 热带作物种质资源抗病虫鉴定技术规程 橡胶树棒孢霉落叶病 1范围 本标准规定了橡胶树[Hevea brasiliensis(Willd.exA.Juss.)Muell.Arg.］棒孢霉落叶病抗病性评 价的术语和定义、病原菌分离鉴定及接种体制备、抗病性鉴定、抗病性评价、抗病性评价有效性判定和结 果记录。 本标准适用于橡胶树棒孢霉落叶病抗病性品系筛 2规范性引用文件 RD 下列文件对于本 文件的 应用是必不 注日期 又注日期的版本适用于本文 单 NY/T 221 橡胶树栽培技 3术语和定义 S 下列术语 和定 义适用 本文件 3. 1 corynes fall dis 由多主棒孢光 cassiicola B Curt侵染引起的真菌 丁造成橡胶树的反 复落叶。橡胶树 奉孢霉落 见附录A的A 3. 2 C 多主棒孢毒 一类由多主 抱病菌 主的奇主 性或 化性的多肽。 3. 3 萎為指数 index 通过对植物叶片 （分损失 数值 4病原菌分离鉴定及接种体制备 4.1病原菌分离鉴定 从发病植株上选取有典型病斑的叶片,用常规组织分离法分离棒孢霉落叶病病原菌,通过单孢分离 法对分离物进行纯化，经致病性测定后， 菌株通过形态学（参见A 1.2)和ITS系统发育学分析确定为多主 棒孢菌，再用多主棒孢毒素的cas2亚型和 亚型特异引物检测确定菌株的毒素类型（参见附录B）， 分别选择cas2亚型和cas5亚型的强致病力菌株用灭菌的超纯水保存备用。 4.2病原菌菌饼接种体制备 将保存的cas2亚型和cas5亚型多主棒孢病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上（平板直径 9cm），（28士1）℃恒温培养7d，用打孔器取菌落外缘的菌饼（直径5.0mm）作为接种体，对照则取同样 大小的空白 PDA培养基。 4.3多主棒孢粗毒素提取液制备 4.3.1改良培养基 改良Fries3号培养基：蔗糖20.0g，酒石酸铵5.0g，KHzPO41.0g，NHNO31.0g，MgSO4· NY/T 3195—2018 7H20 0. 5 g,NaCl 0. 1 g,CaCl² : 2H,0 0. 13 g,酵母膏 1. 0 g,蒸馏水 1 000 mL。 4.3.2粗毒素提取液制备 从培养7d的cas2亚型和cas5亚型多主棒孢病原菌菌落边缘打取3个直径5mm的菌饼,接种于 装有150mL的改良Fries3号培养液（培养液的配方见4.3.1)中，（25士1)℃恒温箱12h光暗交替静置 培养12d。将培养的菌液先用2层无菌纱布过滤；滤液于室温5000r/min离心10min；上清液先用 0.45μm的针筒式微孔滤膜过滤器过滤；再用0.22μm针筒式微孔滤膜过滤器过滤，最后一次滤液即为 多主棒孢粗毒素提取液。制备好的粗毒素提取液于4℃冰箱保存备用。 5抗病性鉴定 5.1病原菌菌饼接种鉴定 5.1.1鉴定设计 鉴定时设"IAN873”为抗病对照品系，“PR107”为感病对照品系。 每个品系选取5片无病斑、完整的橡胶树淡绿期小叶，每片小叶作为1个重复，每个重复设4个接 种点，其中1个接种点为空白对照 5.1.2接种 用无菌的牙签在接种点处轻轻刺伤，将病原菌菌饼有菌丝的一面贴于叶片接种点的伤口处，对照则 用空白PDA培养基贴于伤口处，用无菌的滤纸片蘸无菌水贴于菌饼上，叶片按品系贴好标签，置于 (28士1)℃保湿培养。24h后去除菌饼，继续保湿培养。 5.1.3数据统计 接种处理3d后进行调查。采用十字交叉法量取发病叶片病斑的直径,单位为厘米（cm），计算每张 小叶和品系平均值。 5.2粗毒素生物萎蕉法鉴定 5.2.1鉴定设计 鉴定时设“IAN873”为抗病对照品系，“PR107”为感病对照品系 每个品系选取12片橡胶树淡绿期小叶，每2片小叶作为1个重复，其中4个重复用于粗毒素处理， 2个用空白培养基处理做对照， 5.2.2接种 用消毒的手术剪刀将选取叶片的叶柄去除，称重后，迅速转移到含有20mL粗毒素的50mL离心 管中，以空白改良Fries 3号培养基作为对照。叶柄端朝下插人粗毒素提取液中，处理的橡胶树叶片置 于(25士1)℃的恒温箱中12h光暗交替培养。 5.2.3数据统计 接种处理3d后进行调查。 处理后的叶片用干净的吸水纸吸去叶片表面的液体，称取处理后每张橡胶树叶片的质量，根据处理 后与处理前叶片质量的比值来计算水分损失。 利用式(1)计算处理后的萎焉指数。 (1) R. 式中： WI—萎指数; R。一对照叶片处理后与处理前的质量比值； R，一一处理叶片处理后与处理前的质量比值 5.3自然条件下抗病性评价 2 NY/T 3195—2018 5.3.1对照品系 鉴定时设IAN873”为抗病对照品系，“PR107”为感病对照品系。 5.3.2鉴定圃设计 鉴定圃选址于橡胶树棒孢霉落叶病常发区，地势平坦，土壤理化性质均一，四周无高大乔木，立地环 境一致，每个品系种植30株，完全随机排列，种植规格75cmX75cm，种质圃管理按NY/T221的规定 进行锄草、浇水及施肥，确保苗木生长旺盛 5.3.3调查时间 每年发病高峰期，即9月初调查。 5.3.4调查方法 每年调查1次，每个品系随机调查15株，每 每株随机取中上部12片稳定期小叶，共180片小叶。 5.3.5病情级别划分 病情级别及相对应 勺分级 树棒 病级 十片上无 积占叶片 占叶片面利 5.3.6 病情指类 调查记载每 FCULT ..........(2) 式中: DI R; 值 各级 调查的 抗病性评价 6.1抗病性评价标准 根据病斑直径、萎指数和病情指数确定橡胶树品系对棒 落叶病的抗病性水平，分级标准见 表2。 表2橡胶树棒孢霉落叶病抗病性评价分级标准 病斑直径(D),cm 萎指数（WI） 病情指数(DI) 抗病性等级 D<0.5 WI<10 D<15 高抗（HR) 0. 5≤D<1. 0 10≤WI<20 15≤D<20 中抗(MR) 1.0≤D<1.5 20<WI<30 20≤D<30 轻感(S) 1.5≤D<2. 0 30≤WI<40 30≤D<40 中感(MS) D≥2.0 WI≥40 DI≥40 高感(HS) 6.2 抗病性评价有效性判定 3 NY/T 3195—2018 当感病对照品系(PR107)达到其相应感病程度（病斑直径≥2.0 cm,萎焉指数≥40,病情指数≥ 40)，该批次抗棒孢霉落叶病鉴定视为有效。当3种方法评价的结果有差异时，以抗性水平低的结果为 准。当3种方法的抗病性等级相差2级以上(包括2级)时，该鉴定结果视为无效，应重新进行抗病性鉴 定评价。 7 结果记录 填写橡胶树品系抗棒孢霉落叶病鉴定结果于附录C表格。 4 NY/T 3195—2018 附录A （资料性附录） 橡胶树棒孢霉落叶病 A.1 田间症状 橡胶树棒孢霉落叶病在4月～11月均可发病，发病高峰期为9月，橡胶树幼苗、开割树上的嫩叶 和老叶均能被感染，受害叶片上产生的症状随叶龄、品系的不同而有所变化。叶面上形成浅褐色近 圆形(少数呈现不规则形)坏死病斑,直径1 mm～8mm,病斑中心纸质、边缘深褐色,外围有一黄色晕 圈（图A.la）。受害老叶病斑较大，病斑中心纸质、有些出现“炮弹状”穿孔（图A.1b)，周围的叶组织 黄红色或红褐色，严重时叶片脱落。叶片受害严重叶尖出现皱缩回枯(图A.1c)。受害叶片除了能产 生坏死病斑和萎蕉脱落外，染病叶片上，病菌产生的毒素往往沿叶脉扩展变褐，组织失绿变黄，形成 典型的“鱼骨状”症状（图A.1d)。感病嫩枝和叶柄,通常出现浅褐色长条形病斑；叶柄或叶片基部感 病，则枝条上几乎所有的叶片都会干枯且迅速凋落。植株受害后出现反复落叶，甚至整株枯死。 说明： 圆斑型； 叶尖枯； “炮弹状”穿孔； 典型“鱼骨状”。 图A.1橡胶树棒孢霉落叶病田间症状 A.2病原菌形态 病原菌分生孢子梗单生或数根丛生，直立或弯曲，不分枝，褐色，光滑，大小(100～550）μm×（2～6) um。分生孢子顶生，单生，倒棍棒状、圆柱状，正直或弯曲，淡褐色，光滑，2个～20个假隔膜，顶端钝圆， 基部脐点明显，平截，大小(50～300）μmX（9～22）μm，偶见孢子成链（图A.2)。 5