ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3152.3—2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第3部分：家蚕毒性试验 Risk assessment test guidelines for microbial pesticide- Part 3 : Silkworm toxicity test 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 3152.3—2017 前言 NY/T3152《微生物农药 环境风险评价试验准则》分为6个部分： 第1部分：鸟类毒性试验； 第2部分：蜜蜂毒性试验； —第3部分：家蚕毒性试验； —第4部分：鱼类毒性试验； 一第5部分：泽类毒性试验； 第6部分：藻类生长影响试验。 本部分为NY/T3152的第3部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业部种植业管理司提出并归口。 本部分起草单位：农业部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。 本部分主要起草人：姜辉、卜元卿、杨鸿鹏、周欣欣、王宏伟、宋伟华、单正军。 NY/T 3152. 3—2017 微生物农药环境风险评价试验准则 第3部分：家蚕毒性试验 1 范围 本部分规定了微生物农药对家蚕毒性试验的材料、条 、试验操作、质量控制、试验报告等的基本 要求。 本部分适用于微生物农药登记而进行的家蚕毒性试验 2规范性引用文件 出 是注日期的 日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最 所 本（包括所有的修改单 GB/T31270. 北学农药 境安 评价试验准则 第11 试 3 术语和定义 S 适用于 下列术语和定义 文件 3. 1 A 微生物农药 nicrpbia pesticides 、病毒 生动物或基因修饰的微生物等活体为有效成分， 防治疗 是以细菌、 、真茵 虫、草、鼠等 有害生物作用的农 工 CENTE 3. 2 供试物 substanc 试验中需要测试 的物质 3. 3 R 菌落形成单位 CFU 由单个菌体或聚集成团的多个菌 体在固体培养基 3. 4 细菌芽孢、真菌孢子、细菌或原生动物孢囊 bacterial or ungal spore and terial or protozoan cyst 显微镜下一个完整的个体芽孢 孢子或孢囊， 通常是指能在 合适的培 上形成单个CFU的一个 完整的实体。 3.5 细菌营养体vegetative bacterium 单个活的生物体,通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。 3. 6 原生动物 protozoa 原生动物门各个成员的一个完整的营养体、孢子或孢囊， 3.7 病毒 virus 显微镜下一个完整的病毒颗粒或包涵体。 1 NY/T 3152.3—2017 3. 8 最大危害暴露量maximumhazardexposurelevel 微生物农药有效成分在环境中对非靶生物可能产生危害的最大暴露量，通常以预测暴露量与安全 系数的乘积来表示。 3. 9 毒性toxicity 微生物和/或毒素引起受试生物中毒或病变的能力。其作用过程不一定同时发生微生物的感染、复 制和生命活动。 3. 10 致病性pathogenicity 微生物感染宿主后，在宿主体内存活及繁衍，对宿主造成损伤或病变的能力，通常与宿主的耐受性 或敏感性有关。 3. 11 半数致死量 median lethal dose or concentration,LDso / LCso 在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数死亡所需最小微生物数量或 毒素量。 3. 12 半数感染量median infective dose or concentration, IDso /ICso 在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数感染所需最小微生物数量或 毒素量。 4试验概述 在一定试验条件下,以一定的供试物浓度或剂量测试对受试生物的毒性和致病性等影响。当供试 物最大危害暴露量试验出现对受试生物50%及以上的个体死亡或致病时，则还需进行剂量效应试验和 致死(病)验证试验。致死毒性以 LD5o /LCso表征;致病性以 IDso /ICso值表征, 5 试验方法 5.1材料和条件 5.1.1试验生物 家蚕(Bombyamori),宜选用菁松X皓月、春蕾X镇珠、苏菊X明虎或其他有代表性的品系。以2 龄起蚕作为受试虫，要求受试家蚕健康、大小、龄期一致。 5.1.2供试物 5.1.2.1类型 微生物母药、制剂产品等。 5.1.2.2批次 通常情况下，试验中供试物应采用同一批次的产品。但在不得不使用另一批次产品时，应在试验报 告中记录供试物的批次。 5.1.2.3计数方法 计数方法如下： 细菌可采用稀释平板菌落计数法、荧光定量PCR等测定； 一真菌孢子以CFU为计数单位，可采用稀释平板菌落计数法或血球计数板法等测定； 原生动物以个体数目为计数单位，可采用血球计数板法等测定； 2 NY/T 3152. 3—2017 病毒以包涵体等感染单位为计数单位,可采用荧光定量PCR、血球计数板法等测定； 其他单位，根据微生物的类型和特性选择最适当的计数方法。 以上推荐计数方法,参见附录 A、附录 B、附录 C。 5.1.3主要仪器设备 超净工作台。 灭菌锅。 显微镜。 解镜。 分光光度计。 聚合酶链式反应仪， 温度计。 玻璃器皿。 天平等。 5.1.4试验条件 一般情况下，温度为 奋 长条件下，应充 分考虑供试物的生 5.2试验操作 S 5.2.1试验方法 采用浸叶法进行 试验！ 5.2. 2处理组和对 照绚 试验设置供 物处理维 空白对照组和灭活 照组等 只家蚕。考虑 微生物的传染性，各 处理组及对照组 亲免交叉污染 5.2.3效应观察 试验期间每日 中 并测定全茧量、层量 ENTEY 量 已死 5.2.4试验周期 试验周期从家蚕 龄起天 5.2.5最大危害暴 暴露量试验 以1.0×108单位 或供试物 学用间 施用量的 苞害暴露 两者均能达到时， 取较高值作为最大危害 供试物溶液浓度不 到最大危害暴露量 时,则以供试物在水中能配制得到的最大浓度进行试验 将供试物菌悬液与 粗脉的新鲜桑叶或人 工饲料（配方参见附录D)混合并自然晾干，喂食家蚕24h此后每天喂以不 含供试物的干净桑叶。试验 开始后，每日观察并记录受试家蚕的中毒症状、死亡情况，化蛹结茧后观察化蛹、结茧情况，测定全茧量、 茧层量，并计算化蛹率、结茧率、茧层率。 当受试家蚕在试验期间未 发生死亡，则无需进行剂量效应试验 和致死(病)验证试验；当受试家蚕在试验期间出现50%及以上的个体死亡或致病时,则需进行剂量效 应试验和致死(病)验证试验。 5.2.6剂量效应试验 根据最大危害暴露量试验结果,按一定比例间距设置5组～7组供试物系列浓度，将受试家蚕暴露 于不同浓度的供试物下，试验开始后，每日观察并记录受试家蚕的中毒性症状、死亡情况，化蛹结茧后观 察化蛹、结茧情况，测定全茧量、茧层量,并计算化蛹率、结茧率、茧层率。求出试验结束时供试物对家蚕 的LDso/LCso值或IDso/ICso值及其95%置信限。 5.2.7致死(病)验证试验 3 NY/T 3152. 3—2017 在无菌条件下解剖死蚕或病蚕，分离感染组织并接种至适合的培养基质中,将培养物置于适宜目标 菌株生长条件下培养,分离纯化疑似菌株，疑似菌株经形态学、生理生化及核酸等方法鉴定并确认为目 标菌株后,再以相同暴露途径感染健康的受试家蚕。如果受试家蚕出现与先前试验相同的病症,则证实 目标菌株对受试家蚕具有致死(病)能力。 5.3数据处理 5.3.1统计方法选择 试验结果的数据处理可选择5.3.2、5.3.3中所述的统计学方法，也可根据试验情况选择其他合适 的统计方法。 5.3.2差异显著性检验 5.3.2.1概述 差异显著性检验推荐采用独立样本 t检验或单因子方差分析(One-Way ANOVA,LSD检验)等。 显著水平取p<0.05(差异显著)、p<0.01(差异极显著)。 5.3.2.2独立样本t检验 2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式(1)计算。 Xi -X2 + n-1 式中： X1,X2 分别为两样本平均数； 分别为两样本方差； n 样本容量。 5. 3. 2. 3 One-Way ANOVA方差分析(LSD 检验) 3组及以上均值比较时可进行方差分析。LSD检验按式(2)计算。 LSD. = ta(df,)St,- (2) 式中： ta(df.) 在F检验中误差自由度下，显著水平为α的临界t值； Ss,一, 均数差异标准误,按式(3)计算。 Ss,-, = V2MS./n (3) 式中： MS。 F检验中误差均方； n 各处理重复数。 5.3.3半数致死量或半数感染量计算 家蚕半数致死浓度LC50或半数感染浓度IC50的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法 估算，也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。具体计算方法见GB/T31270.11。 5.4质量控制 质量控制条件如下： 对照组受试家蚕死亡率不超过10%； 实验室内应定期(蚕卵每批一次，同批蚕卵至少每2个月一次)进行乐果参比物质试验，以保证 受试家蚕的稳定性。 6试验报告 试验报告应包括下列内容： 4 NY/T 3152.3—2017 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号； 试验委托单位和联系方式、样品受理日期和封样情况； 试验开始