ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3147—2017 饲料中肾上腺素和异丙肾上腺素的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of epinephrine and isoprinosine in feeds- Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) 2018-06-01实施 2017-12-22 发布 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 3147—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 (北京)]。 本标准主要起草人：索德成、魏书林、王培龙、李阳、王瑞国、苏晓鸥、樊霞、李宏、周炜、冯三令 NY/T 3147—2017 饲料中肾上腺素和异丙肾上腺素的测定，液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了饲料中肾上腺素（epinephrine)和异丙肾上腺素(isoprinosine)含量测定的液相色谱 串联质谱法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料及精料补充料中肾上腺素和异丙肾上腺素的 测定。 肾上腺素检出限为10 μg/kg,定量限为 20 pμg/kg;异丙肾上腺素检出限为 5 μg/ kg,定量限为 10 μg/ kg. 2规范性引用文件 是注日期白 的引 件。凡是不注日期的引月 用文体其 最新 本(包括所有的修改单) 用 GB/T 6682 析实验室 用水规格和试验方 GB/T 1469 66 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲米 试样的制 3原理 合型阳离子固相萃取柱净化、吹干稀释溶解 普-串联质谱仪检 测，内标法定量 4试剂与材料 C 除非另有说明 均为分析纯试剂，实验 用水 级水的规定。 4.1甲醇：色谱 4.2甲酸：色谱 RI 4.3七氟丁酸：色谱 4.4肾上腺素、异丙 泉素、 腺素-D6 对照品:纯度≥ 4.5试样提取液：称取 .90g焦亚硫酸钠溶液、1.86g乙二胺四乙酸二 钠加 50mL水，加50mL乙 睛混合均匀。 4.63.0mmol/L七氟丁酸溶液:准确吸取七氟丁酸0.40 mL,加水 000mL，混匀。 4.7试样稀释液：取乙腈10mL,加3.0mmo 七氟丁酸溶液(4.6)100mL,混匀。 4.8肾上腺素和异丙肾上腺素标准储备液:分别精密称取肾上腺素和异丙肾上腺素对照品(精确至 0.00001g)至棕色容量瓶中,用甲醇(4.1)配成浓度各为1mg/mL的标准储备液，2℃～8℃冷藏保存， 有效期6个月。 4.9肾上腺素和异丙肾上腺素标准工作液:分别吸取肾上腺素和异丙肾上腺素标准储备液(4.8),用试 样稀释液（4.7)稀释成浓度为1μg/mL的标准工作液,2℃～8℃冷藏保存,有效期1个月。 4.10肾上腺素-D6同位素内标储备溶液：分别精密称取肾上腺素-D6对照品(精确至0.00001g)至 棕色容量瓶中,用甲醇(4.1)配成浓度各为1mg/mL的标准储备液，2℃～8℃冷藏保存,有效期6个月 4. 11肾上腺素-D6 同位素内标工作液:临用前配制,将肾上腺素-D6 同位素内标储备溶液(4. 10)用甲 1 NY/T 3147—2017 醇(4.1)稀释至 1 μg/mL。 4.12氨水甲醇溶液：取5mL氨水与95mL甲醇混合。 4.13氮气：纯度99.9%。 4.14固相萃取小柱:混合型阳离子交换柱(3mL,60 mg),或其他性能相当的小柱。 4.15滤膜：0.22μm,有机系。 5仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾电离源。 5.2离心机:转速不低于8 000 r/min。 5.3氮吹仪。 5.4涡旋振荡器。 5.5粉碎机。 5.6恒温水浴振荡摇床。 5.7固相萃取装置。 5.8天平:感量0.01g;感量0.00001g。 6采样和试样的制备 按GB/T14699.1的规定抽取有代表性的样品，用四分法缩减取样，按照GB/T20195的规定制备 试样，粉碎过0.45mm孔径筛，混合均匀，装入磨口瓶中备用。 7分析步骤 7.1提取 称取配合饲料5g，浓缩饲料、添加剂预混合饲料及精料补充料2g(精确至0.01g)于50mL离心管 中，准确加人20μL肾上腺素-D6同位素内标工作液（4.11)、20mL试样提取液（4.5），涡旋混合30s，超 声提取30min，8000r/min离心5min，上清液备用。 7.2净化 固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL水活化。取适量或全部上清液过柱，依次用3mL水和2mL 甲醇淋洗，抽干，用3mL氨水甲醇溶液（4.12)洗脱，收集洗脱液，速度控制在约1滴/s，用氮吹仪在 30℃条件下氮气吹干，用1.0mL试样稀释液（4.7)溶解，过0.22μm滤膜。如果检测含量超出线性范围 （1μg/L～100μg/L),适当减少称样量重新处理或减少过固相萃取小柱的溶液量,将上机溶液所含药物 的浓度稀释至线性范围内上样。 7.3液相色谱参考条件 色谱柱：Cig柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径2.1μm(或其他效果等同的Cig柱）。 柱温：30℃。 进样量：10μL。 流动相及参考梯度洗脱程序见表1。 表1流动相及参考梯度洗脱程序 时间，min 流速,mL/min 3.0mmol/L七氟丁酸溶液，% 乙腈,% 0 0. 3 98 2 1 0. 3 98 2 5. 0 0. 3 70 30 2 NY/T 3147—2017 表1 (续) 时间，min 流速,mL/min 3.0mmol/L七氟丁酸溶液，% 乙腈,% 6. 0 0.3 70 30 6. 1 0. 3 98 2 8. 0 0. 3 98 2 注：七氟丁酸对检测负离子有抑制作用，如需检测其他药物，应用适量的50%甲醇和水溶液冲洗色谱和质谱。 7.4质谱参考条件 离子源：电喷雾离子源。 扫描方式：正离子模式。 检测方式：多反应监测。 脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏 度达到检测要求。 毛细管电压、碰撞能量等电压值应优化至最佳灵敏度 定性离子对、定量离子对及对应碰撞能量见表2。 表 2肾上腺素和异丙肾上腺素的定性离子对、定量离子对、碰撞能量的参考值 被测物名称 定性离子对,m/z 定量离子对，m/z 碰撞能量,eV 184.1>166. 2 20 肾上腺素 184.1>166.2 25 184.1>130.3 212.2>152.2 20 异丙肾上腺素 212.2>152.2 212. 2>194. 1 25 肾上腺素-D6 190.2>172.0 190.2>172.0 20 7.5定性测定 每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间 与混合标准工作液中对应的保留时间偏差在士0.5之内,且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与 浓度接近的标准工作液中对应的定性离子的相对丰度进行比较,若偏差不超过表3规定的范围,则可判 定为样品中存在对应的待测物。 表 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许误差 单位为百分率 >50 20～50(含) 10~20（含） ≤10 相对离子丰度 允许的最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 7.6定量测定 在仪器最佳工作条件下,取试样溶液和标准溶液分别进样，以标准溶液中被测组分峰面积和其内标 峰面积的比值为纵坐标，被测组分浓度和内标浓度的比值为横坐标,用标准系列进行单点或多点校准， 采用内标法定量,以肾上腺素-D6为内标物计算肾上腺素、异丙肾上腺素含量。试样溶液中待测物的响 应值均应在仪器测定的线性范围(1μg/L～100μg/L)内,在上述色谱和质谱条件下,肾上腺素和异丙肾 上腺素标准溶液的液相色谱-串联质谱离子流色谱图参见附录A。 8 计算 试样中肾上腺素和异丙肾上腺素的质量分数X；以毫克每千克(mg/kg)表示,按式(1)计算。 P, XVi Xc; X Vs X P X cs X 1000 X; = (1) P,XmXV²X PsXcX1000 式中： 3 NY/T 3147—2017 P; 试样溶液中肾上腺素和异丙肾上腺素的峰面积值； Vi 试样提取液体积,单位为毫升(mL)； Ci 肾上腺素和异丙肾上腺素标准溶液浓度,单位为微克每毫升（μg/mL); V3 上机前定容体积，单位为毫升（mL）； P ist 肾上腺素内标的峰面积值; Csis 样品溶液中肾上腺素内标溶液浓度,单位为微克每毫升（μg/mL)； Pa 标准溶液峰面积平均值； m 试样质量,单位为克(g)； V2 净化时分取溶液的体积，单位为毫升（mL）； Pis 试样溶液中肾上腺素内标的峰面积值； 标准溶液中肾上腺素内标溶液浓度,单位为微克每毫升(μg/mL)。 Cis 'SHIN 重复性 在重复性条件下,获得 定 均值 这2个值的算术平 均值的20%。 NY/T 3147—2017 附录A （资料性附录） 肾上腺素和异丙肾上腺素标准溶液的液相色谱-串联质谱离子流色谱图 肾上腺素和异丙肾上腺素标准溶液的液相色谱-串联质谱离子流色谱图见图A.1。 RT:4.83 AA:3445574 响应值 SN:3119 300 000 E 250000 200 000 150 000 100 000 50 000 0.36 1.27 2.44 3.48 5.91 0 RT:4.76 AA:28