ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3142—2017 饲料中溴吡斯的明的测定 液相色谱一串联质谱法 Determination of pyridostigmine bromide in feeds- Liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2017-12-22 发布 2018-06-01 实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 3142—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：广东省农业科学院农产品公共监测中心。 本标准主要起草人：何绮霞、王威利、张展、续倩、吴维輝、林雪贤、殷秋妙。 I NY/T 3142—2017 饲料中溴吡斯的明的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了饲料中溴吡斯的明含量测定的液相色谱-串联质谱法 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中溴吡斯的明的测定。 本标准检出限为1μg/kg，定量限为 J2μg/kg 2规范性引用文件 PUBLI 件。凡是不注日期的引 用文件 （包括 GB/T6682 元 析实 验室用水 GB/T 14699. 采样 料 RESE GB/T 20195 动物饲料 式样的制备 S 3原理 醇或乙腈超声提取，提取液 超纯水溶解 1相萃取柱净化， 液相色谱-串联质谱 内标法定量。 4试剂 除非另有说明 4.1.乙腈：色谱 4.2甲醇:色谱纯 4.3甲酸：色谱纯 4. 4 甲酸铵：色谱 4.5 正已烷：分析纯 人 4.6 1%甲酸甲醇溶液 4.7 5mmol/ L甲酸铵甲酸溶液:取甲酸铵 0. 315 g 和甲酸 1. 0 ml,用水定容 1000mL。 4. 8 复溶液：甲酸铵甲酸溶液（4 +乙腈 90+10. 4. 9 复溶液饱和的正已烷：在正已烷中加人复溶液（4.8)，直至） ,振荡后静置待用。 4. 10 溴吡斯的明标准品：纯度98.0%。 4. 11 溴吡斯的明-D。标准品（同位素内标物）：纯度≥98.0%。 4.12溴吡斯的明标准储备液（1mg/mL）：准确称取适量溴吡斯的明标准品，用色谱纯甲醇配制成 1000μg/mL的标准储备液，一20℃储藏，有效期6个月。 4.13溴吡斯的明标准工作液（0.1μg/mL）：准确量取溴吡斯的明标准储备液（4.12），用色谱纯甲醇稀 释成溴吡斯的明浓度为0.1μg/mL的标准工作液，4℃储藏，有效期1个月。 4.14溴吡斯的明-D（4.11)标准储备液(1mg/mL）：准确称取适量溴吡斯的明-D。标准品，用色谱纯 甲醇配制成1000μg/mL的标准储备液，一20℃储藏，有效期6个月 4. 15溴吡斯的明-D。标准工作液(0. 1 μg/mL):准确量取溴吡斯的明-D。标准储备液(4. 14),用色谱 NY/T 3142—2017 纯甲醇稀释成溴吡斯的明浓度为0.1μg/mL的标准工作液，4℃储藏，有效期1个月。 5仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱联用仪：配电喷雾离子源（ESI)。 5.2分析天平：感量0.1mg。 5.3分析天平：感量0.01mg。 5.4涡旋振荡器。 5.5超声水浴。 5.6 离心机：最高转速12000r/min或以上。 5.7氮吹仪。 5.8固相萃取装置。 5.9滤膜：0.22μm。 5. 10 固相萃取小柱：混合型弱阳离子交换柱（WCX），150mg/3mL；或相当者。 6试样制备 按照GB/T14699.1的规定抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样，按照GB/T20195的规 定制备样品，粉碎后过0.45mm孔径的分析筛，混匀，装入磨口瓶中，备用。 7测定步骤 7.1提取 7.1.1配合饲料、浓缩饲料、精料补充料 称取试样约2g（精确至0.1mg），准确加人溴吡斯的明-D标准工作液（4.15)100μL，加入甲醇 （4.2)20mL，涡旋30s，超声提取10min，10000r/min离心5min，准确取上清液10mL，置于水浴锅中 50℃氮气吹干，准确加水10mL溶解，加人10mL正已烷（4.5），涡旋30s，10000r/min离心5min，准 确取下层液体5mL，为样品提取液。 7.1.2添加剂预混合饲料 称取试样约2g(精确至0.1mg),准确加人溴吡斯的明-D标准工作液（4.15)100μL，加人乙睛 (4.1)20mL，涡旋30s，超声提取10min，10000r/min离心5min，准确取上清液10mL，置于水浴锅中 50℃氮气吹干，准确加水10mL溶解，加人10mL正已烷（4.5），涡旋30s，10000r/min离心5min，准 确取下层液体5mL，为样品提取液。 7.2净化 取混合型弱阳离子交换柱（WCX），依次用甲醇6mL、水6mL活化，取样品提取液（7.1)过柱，弃去 流出液,再依次用水6mL、甲醇6mL淋洗，减压抽干，用1%甲酸甲醇溶液（4.6)10mL洗脱，洗脱液于 水浴锅中50℃氮气吹干，用复溶液（4.8)0.5mL超声溶解，加人0.5mL复溶液饱和的正已烷（4.9），涡 旋30s12000r/min离心5min，取下层液体，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.3标准曲线的制备 精密吸取溴吡斯的明标准工作液（4.13)和溴吡斯的明-D。标准工作液（4.15），用复溶液稀释成 0.5ng/mL、1 ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的系列标准溶 液（溴吡斯的明-D。均为5ng/mL），供液相色谱一串联质谱法测定。 7.4测定 7.4.1色谱参考条件 2 NY/T 3142—2017 色谱柱：Cg柱，柱长150mm，内径3.0mm，粒径3um;或相当者； 流动相A：5mmol/L甲酸铵/0.1%甲酸水溶液（4.7)；流动相B：乙，梯度洗脱程序见表1； 流速:0.3mL/min; 柱温：40℃； 进样量：5μL。 表1梯度洗脱程序 时间，min 流动相 A,% 流动相B,% 0.0 97 3 1. 2 85 15 5. 8 85 15 6. 5 50 50 8.0 50 50 8.5 97 3 12.0 97 3 7.4.2质谱参考条件 离子源：电喷雾离子源； 扫描方式：MRM; 电离模式：正离子模式； 检测方式：多反应监测（MRM)； 电离电压：4.5kV； 雾化温度：400℃； 脱溶剂温度：250℃； 雾化气流速：3.0L/min； 干燥气流速：15.0L/min。 溴吡斯的明和溴吡斯的明-D。定性离子对、定量离子对及碰撞能量参数见表2。 表2溴吡斯的明和溴吡斯的明-D。的定性离子对、定量离子对及碰撞能量 定性离子对 定量离子对 碰撞能量 化合物 m/z m/ z eV 181.15/72.10 21 溴吡斯的明 181.15/72.10 181.15/124.20 16 溴吡斯的明-D 187.10/78.20 187.10/78.20 21 7.4.3定性测定 在相同试验条件下，待测物在样品中的保留时间与标准溶液中的保留时间偏差在土2.5%之内，并 且色谱图中各组分定性离子对的相对丰度与浓度接近标准液中相应定性离子对的相对丰度进行比较， 若偏差不超过表3规定的范围，则可判断为样品中存在对应的待测物。 表3定性测定时相对离子丰度的最大允许误差 单位为百分率 相对离子丰度 >50 20～50(含) 10～20(含) <10 允许的相对偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 7.4.4定量测定 取试样溶液和标准溶液上机测定，以色谱峰保留时间和离子对定性，以溴吡斯的明和溴吡斯的明 D。的色谱峰面积比做单点或标准曲线校准，用内标法定量。试样溶液中目标物与内标的峰面积比均应 3 NY/T 3142—2017 在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，溴吡斯的明标准溶液特征离子的质量色谱图参见 附录A。按以上步骤对同一试样进行平行测定。 8 结果计算 试样中溴吡斯的明的含量(X)以质量分数表示，单位为微克每千克(μg/kg),按式(1)或式(2)计算。 单点校准：X= AXA XC, XC, XVX 1000 XN A,X A,XCXmX1000 （1) 式中： A 试样溶液中溴吡斯的明的峰面积； As 标准溶液中内标溴吡斯的明-D的峰面 C; 试样溶液中内标溴吡斯的明-D。的泌度,为纳克每毫升(ng/ mL) ; C, V 最终定容体 位为毫升(mL A, 标准溶液 斯的明的峰面积 E A; 试样溶 内标溴吡斯的明 D。的峰面积; Cs 标准溶液 内标溴吡斯的明 的浓 纳克每毫升 m 试样 质量 单位为 (g); N 提取 希释倍数 测定结果用 测定的算术平均值表未,保留 3 位有效 URA 或标准曲线校 .....(2) m X 1000 式中： 由标准 线得出 mL; V 最终 体积， CEN 测定结果用 测定的 C 9 重复性 在重复性条件 下获 绝对值不 这2个测定值食 均值的25%。 NY/T 3142—2017 附 A (资料性附录) 溴吡斯的明标准溶液色谱图 溴吡斯的明标准溶液色谱图参见图A.1。 ×10 000 181.15 > 72.10(+) α 1 (1) 4.769溴吡斯的明 2.00 1.00F 0.00 187.10 > 78.20(+)α 2 (1) 5.00 4.766溴吡斯的明-D 4.00 3.00 2.00 1