ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3138—2017 饲料中艾司唑仑的测定 高效液相色谱法 Determination of estazolam in feeds- High performance liquid chromatography 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 3138—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心（广州）。 本标准主要起草人：肖田安、方秋华、廖雁平、江庆娣、陈运勤、伍宏凯、胡苑玲。 H NY/T 3138—2017 饲料中艾司唑仑的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了饲料中艾司唑仑测定的高效液相色谱法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料以及精料补充料中艾司唑仑的测定。 本标准中艾司唑仑的检出限为0.10mg/kg，定量限为0.25mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的P凡是目期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 BERAS GB/T 6682 分析 实验室 用水规格和 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲料误 3原理 Y S 仑在碱 纸甲烧捷 试样中的艾 同必 性条件下用正 相萃取 效液相色谱法检 JRAL 测，外标法定量 4 试剂与材料 除另有说明 用试 T6682.中 一级水的 4.1艾司唑仑） 对 4.2乙腈：色谱 4.3甲醇：色谱纯 4.4氯化钠。 4.5碳酸钠。 4.6磷酸二氢钾。 4. 7 二氯甲烷。 4.8 正已烷。 4.9甲酸。 4. 10 氨水。 4. 11 10%碳酸钠水溶液：取碳酸钠100g,用水溶解并稀释至1000mL。 4. 12 2%甲酸水溶液：取甲酸2mL，用水稀释至100mL。 4. 13 35%氨水甲醇溶液：取氨水10mL,加甲醇至200mL，混匀。 4.140.4%磷酸二氢钾溶液：取磷酸二氢钾4g,用水溶解并稀释至1000mL。 4.15提取液：取二氯甲烷与正已烷以体积比1：1的比例混匀。 4.16 艾司唑仑标准储备溶液（1.0mg/mL）：准确称取艾司唑仑标准品50.00mg，于50mL容量瓶中， 用甲醇（4.3)溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备溶液。4℃保存，保存期6个月。 4. 17艾司唑仑标准工作溶液(50 μg/mL):准确量取艾司唑仑标准储备溶液(4.16)1 mL,于 20 mL容 NY/T 3138—2017 量瓶中，用甲醇（4.3)稀释并定容，配制成浓度为50μg/mL的标准工作溶液。4℃保存，保存期3个月。 4.18固相萃取柱：混合型阳离子交换柱，60mg/3mL；或相当者。 5仪器设备 5.1高效液相色谱仪：配二极管阵列检测器。 5.2分析天平：感量0.01mg。 5.3天平：感量0.001g。 5.4离心机:转速为5000r/min及以上。 5.5水平振荡器。 5.6涡旋混合器。 5.7 旋转蒸发仪。 5.8固相萃取装置。 5.9氮吹仪。 5.10微孔滤膜：0.45μm，有机相。 6试样制备 按照GB/T14699.1的规定抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按照GB/T20195的 规定制备样品，粉碎后过0.45mm孔径的分析筛，充分混匀，装入磨口瓶中，密闭备用。 7分析步骤 7.1提取 称取试料2g（精确到0.001g），于50mL聚丙烯离心管中。加人水20mL，用10%碳酸钠水溶液 (4.11)调pH至8.5～9.0,加人氯化钠1g。加人提取液（4.15)15mL，中速振荡10min后，5000r/min 离心5min，将上层有机相转人梨形瓶中。残渣再用提取液（4.15)15mL重复提取一次，合并提取液，在 (35土2)℃下旋转蒸发至干。用5mL甲醇（4.3)溶解梨形瓶中的残留物，备用。 7.2净化 MCX固相萃取柱用3mL甲醇（4.3）、3mL水活化，取备用液（7.1)过柱，用3mL2%甲酸水溶液 （4.12）、3mL甲醇（4.3)淋洗，用5%氨水甲醇溶液（4.13)6mL洗脱，收集洗脱液，45℃下氮气吹干，准 确加人1.0mL甲醇（4.3)溶解残渣，过0.45μm的滤膜，供高效液相色谱测定。 7.3标准曲线的制备 精密量取艾司唑仑标准工作溶液（4.17)适量，用甲醇（4.3）稀释，配制成浓度为0.20μg/mL、0.50 μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL的系列标准溶液，供高效液相 色谱分析。以色谱峰面积为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程。 8测定 8.1液相色谱参考条件 色谱柱：Cl8柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm;或性能相当者； 流动相A为乙腈，流动相B为0.4%磷酸二氢钾溶液，梯度洗脱程序见表1； 流速：1.0mL/min; 检测波长：222nm； 进样量：20μL； 2 NY/T 3138—2017 柱温：30℃。 表1艾司唑仑梯度洗脱程序表 时间，min 流动相 A,% 流动相 B,% 0. 0 44 56 10 44 56 11 75 25 15 75 25 16 44 56 20 44 56 8.2定性测定 在仪器最佳工作条件下，试样中待测物的保留时间与艾司唑仑标准溶液中对应的保留时间相对偏 差在土2.5%之内，且二者光谱图一致，则可判定试样中存在对应的待测物。光谱图参见附录A中的图 A.1。 8.3定量测定 按照上述液相色谱条件测定试样溶液和标准溶液，以色谱峰面积进行单点或多点校正定量，试样溶 液中待测物的响应值应在仪器测定的线性范围内。标准溶液的高效液相色谱图参见图A.2。 9结果计算与表示 9.1结果计算 9.1.1单点校准 试样中艾司唑仑的含量X,以质量分数表示，单位为毫克每千克(mg/kg），按式(1)计算。 AXCs XV （1) AsXm 式中： X 试样中艾司唑仑的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)； Cs 标准溶液中艾司唑仑的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL)； A 试样溶液中艾司唑仑的峰面积； As 标准溶液中艾司唑仑的峰面积； V 净化后定容的体积，单位为毫升(mL）； m 试样的质量,单位为克(g); 稀释倍数。 9. 1. 2 多点校准 试样中艾司唑仑的含量X，以质量分数表示，单位为毫克每千克（mg/kg），按式(2)计算。 CX V (2) m 式中： Q. 由标准曲线得出的试样溶液中艾司唑仑的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）。 9.2结果表示 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。 10重复性 在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不大于这2个测定值的算术平均值的20%。 3 NY/T 3138—2017 附录A (资料性附录) 艾司唑仑标准溶液光谱图和色谱图 A.1艾司唑仑标准溶液光谱图 见图A.1。 mAU 10 0 AL 图 艾司唑仑标准溶液光谱图 A. 2 艾司唑仑标准 谱图 见图A.2 一 mAU 25 20 15 10 5 人 0 0 12 t,min 图A.2 艾司唑仑标准溶液(1.0 μg/mL)色谱图 NY/T 3138-2017 中华人民共和国 农业行业标准 饲料中艾司唑仑的测定 高效液相色谱法 NY/T3138—2017 * * * 中国农业出版社出版 (北京市朝阳区麦子店街18号楼) （邮政编码：100125 网址：www.ccap.com.cn) 北京印刷一厂印刷 新华书店北京发行所发行各地新华书店经销 * * * 开本880mmX1230mm1/16 印张0.75 字数15千字 2018年5月第1版 2018年5月北京第1次印刷 书号：16109·4344 定价：18.00元 版权专有侵权必究 NY/T3138-2017 举报电话：（010）65005894