ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3091—2017 化学农药 虾蚂繁殖试验准则 Chemical pesticide-Guideline for earthworm reproduction test 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T3091—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准主要技术内容等效采用了经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则No.222《虾蚓繁殖 试验》。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业部种植业司提出并归口。 本标准起草单位：农业部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所 本标准主要起草人：姜锦林、曲、卜元卿、周欣欣、程燕、周艳明、单正军。 NY/T3091—2017 化学农药 蚓繁殖试验准则 1范围 本标准规定了虾蚓繁殖试验的术语和定义、供试物信息、试验概述、试验方法、数据处理与分析、质 量控制、试验报告等的基本要求。 本标准适用于为化学农药登记而进行的蚓繁殖毒性试验，其他类型的农药可参照使用。 本标准不适用于挥发性的化学农药 本标准没有考虑供试物在试验期间可能发生的降解， 如有必要，可在试验开始和结束时对试验体 系中供试物浓度进行分析 2 规范性引用文件 下列文件对 件的应用 少的。凡是注日期 件，仅注 升用文 日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的 引用又件 适用于 501 化学农药环境安全评价试验准！ 第11 分斯虾 GB/T31270 引急性毒性试验 S S 3术语和定义 下列术语和 定义适用 F本文件 R 3. 1 X%效应浓 度 给定的试验 期限内 如 半效应浓度 （EC5。）指经过给定的暴露时间，在试验终点时引起受试生 物50% 冲效应的 衣度，用EC×表示。 注：单位为毫克 3. 2 C 无致死浓度 h0Tetha oncentration 给定的试验 死效应的供试物最大浓度，用 期 注：单位为毫克有效 3.3 半致死浓度 median lethal concentration 给定的试验期限内，引起受试生物半数致 注：单位为毫克有效成分每千克 十±(mg a. i. /kg 干±)。 3. 4 全致死浓度 totallylethal concentration 给定的试验期限内，引起受试生物全部死亡的最小供试物浓度，用LC10o表示。 注：单位为毫克有效成分每千克干土（mga.i./kg干土）。 3.5 最低可观察效应浓度 lowestobservedeffectconcentration 给定试验期限内，与空白对照组相比，供试物对受试生物产生具有统计学显著性差异的不利效应 （P<0.05)的最低浓度，即供试物对受试生物有不利影响的最低浓度，用LOEC表示。 注：单位为毫克有效成分每千克干土（mga.i./kg干土）。 1 NY/T3091—2017 3. 6 无可观察效应浓度noobservedeffectconcentration 给定试验期限内，与空白对照组相比，未观察到供试物对受试生物产生具有统计学显著性差异的不 利效应（P<0.05)的供试物最高浓度，一般为仅低于LOEC的供试物最高浓度，用NOEC表示。 注：单位为毫克有效成分每千克干土（mga.i./kg于土）。 3.7 成蚓adultworms 身体前部出现生殖带的成年蚯蚓。 3.8 生殖带clitellum 成蚓前端表皮的一个腺体，呈马鞍形或环状，通常有明显不同的颜色。 3.9 繁殖率reproductionrate 试验期内每条成蚓生产的幼蚓数量的平均值。 3. 10 行为症状behavioralsymptoms 供试物引起虾蚓中毒后的非正常生物学行为的描述指标。一般包括在土壤表面翻滚、僵硬缩短、伸 长并且做脉冲式运动，或者在土壤中停止活动，缩成一团。蚯蚓在测试容器中的每一个可辨别的明显 变化。 3. 11 死亡mortality 用细小的针刺供试蚓的前部和尾部，没有明显反应的生物个体。由于虾蚓死亡后分解很快，在密 闭实验容器的土壤中引人活虾蚓数量的损失也可认定为死亡发生。 4试验概述 通过不同浓度的供试物溶液与定量的人工配制土壤混合，引入定量健康、具稳定繁殖力的成蚓，并 在4周内观察试验土壤中成蚓死亡率和生长受影响状况；移出观察到的成蚓，继续暴露4周，观察、统计 土壤中的子代蚯蚓数量。 供试物浓度范围的选择应包括在8周试验期间可能会引起亚致死和致死效应的浓度，目标ECx值 也应在该浓度范围内，使得ECx的估算是来自内插法而不是外推法。通过统计分析供试物处理组和空 白对照组繁殖率的差异，确定LOEC和NOEC,或通过回归模型来估算EC（如EC1o和EC5o）。 5试验方法 5.1材料和条件 5.1.1供试生物 本标准使用赤子爱胜蚓（Eiseniafoetida）和安德爱胜蚓（Eiseniaandrei）作为受试生物，选择具有 生殖带的两个月至一年大小的成蚓，来自同一生长环境，大小均匀、年龄一致（差别不宜超过4周）。试 验前，虾蚂在供试人工土壤环境中驯养至少1d，驯养期间使用的食物应和正式试验中的食物保持一致。 蚓培养方法参见附录A。 驯养后的成蚓用去离子水清洗干净，用滤纸吸去多余水分，每10条蚓为一组，每组单独称重，每 条虾蚓的重量应控制在250mg～600mg。称重后成蚓在试验开始前随机分配到各试验培养容器中。 5.1.2供试物 2 NY/T3091—2017 供试物可使用农药制剂、原药。难溶于水的供试物可用少量对虾蚓低毒的有机溶剂助溶，或直接用 适量对蚓低毒有机溶剂(如丙酮)溶解。供试物应至少给出下列信息： a）化学结构式； b）纯度； c) 水溶性； d）水中和光中的稳定性； e）辛醇一水分配系数； f）蒸汽压。 5.1.3参比物质 使用多菌灵（Carbendazim）或苯菌灵（Benomyl)作为参比物质，其对蚯蚓繁殖可观测到的显著抑制 效应在1mga.i./kg干土 5mga.1. /hm 500ga.i./hm²或25mga.i./m²~ 50 mg a.i. /m²。 5.1.4供试土壤 ARD 人工土壤由70 之间颗粒的细砂 超 50% 岭土、10%泥炭藓（土 合纟 始pH应在6.0士 0.5，可通过添加 活 的碳酸钙（0.3% %00 行调 充分机械混合 量（WHC）的40%~ 60%，并确保 基质放在 手单压紧时无水分流出 人十士壤最大持水量测定方法 长见附录B，人工土壤 pH测定方法 附录 AR 5.1.5主要仪器设备 5.1.5.1标本 容器（横截面积宜在200cm左右：容积1L HO 瓦或真在 500g~600g试验 用人工土壤后 在5cm6cm.容器口加盖透气透光的盖板 5.1.5.2pl 和光度 5.1.5.3电子 5.1.5.4温湿度 可密的 5.1.5.5容量 5.1.5.6镊子、 5.1.5.7水浴锅等 5.1.6试验条件 试验温度为（20土2） 长照强度4001x -800 光暗时间比为16h 试验期间不向试验容器 中充气，但容器盖的设计应允许气体交换，同时还限制水分的过度蒸发 期称重试验容器（去盖）来监 测土壤的含水量。必要时，添加去离子水来补充水量损失，使试验人 工土壤含水量变化的范围不超过初 始含水量的10%。 5.2试验操作 5.2.1染毒 5.2.1.1基本要求 根据测试目的来选择染毒方式，一般可将供试物溶液与试验人工土壤均匀混合。在设计更细致的 染毒试验中，也可直接将供试物施于土壤表面，或与常规农业操作一致（例如：喷洒液体制剂，或使用 些特殊的剂型如颗粒剂和种衣剂时）。当供试物或参比物质染毒过程中使用有机溶剂时，有机溶剂应对 虾蚓低毒，且在试验设计中应以最大溶剂使用量设置溶剂对照组。 5.2.1.2土壤混合染毒 3 NY/T3091—2017 使用均匀混合法染毒时，根据供试物理化特性可按下列3种情况进行： a） 供试物易溶于水：试验开始前，按设计浓度需要，配制足够的供试物去离子水溶液，使其可以满 足一个处理所有重复组的使用量。将各浓度的适量药液加人到人工土壤中，补充去离子水以 使土壤最终含水量达到其最大持水量的40%～60%，混合均匀后放入试验容器中待用。 b）供试物难溶于水：将供试物用少量适宜有机溶剂（如丙酮)溶解，均匀喷洒或混入少量细石英砂 中，置于通风橱中至少数分钟，使有机溶剂蒸发。之后将处理过的石英砂与预先湿润的人工土 壤配料混合均匀，补充去离子水，使土壤最终含水量达到其最大持水量的40%～60%，混合均 匀后放人试验容器中待用。 供试物不溶于水和有机溶剂：将10g细石英砂与供试物混合，制成均匀混合物，然后将该混合 物均匀混人预先湿润的其他人工土壤配料中，补充去离子水以使土壤最终含水量达到其最大 持水量的40%～60%，混合均匀后放入试验容器中待用。 5.2.1.3土壤表面染毒 将配置好的人工土壤置于容器中，然后将蚯蚓置于土壤表层。通常健康的虾蚓会立即钻入土中，若 15min后还未钻人土中的蚯蚓则视为受伤，应予更换，所有更换和被更换的虾蚓应称重，以确保试验开 始时处理组蚯蚓总重和加上容器一起的总重量均为已知。 当加人的虾蚓均转入土壤后，使用适宜喷洒装置将配置好的供试物各浓度组药液分别定量均匀喷 酒在土壤表面，施用前应先移去容器盖子，并向容器内加一个衬里，以避免供试物喷洒到试验容器壁上。 上述操作过程应避免蚯蚓与供试物药液直接皮肤接触，且室内温度应保持在（20土2)℃，药液喷施量应 控