ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3081—2017 番茄抗番茄黄化曲叶病毒鉴定技术规程 Rule for evaluation of tomato resistance to tomato yellow leaf curl virus 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T3081—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出。 本标准由全国蔬菜标准化技术委员会（SAC/TC467)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。 本标准主要起草人：谢丙炎、冯兰香、杨宇红、苏振川、陈国华、凌键、杨翠荣， NY/T3081—2017 番茄抗番茄黄化曲叶病毒鉴定技术规程 1范围 本标准规定了番茄抗番茄黄化曲叶病毒（tomatoyellowleafcurlvirus）的鉴定方法和评价方法。 本标准适用于所有番茄（SolanumlycopersicumL.）品种及材料抗番茄黄化曲叶病毒的室内鉴定 及抗性评价。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 NY/T1858.7界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 番茄黄化曲叶病毒tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV 属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomouirus），病毒粒体为双联体结构，由 两个不完整的二十面体组成，无包膜。是一种通过烟粉虱和嫁接传播，可严重危害多种双子叶植物的重 要病毒。 3. 2 番茄黄化曲叶病tomatoyellowleafcurldisease，TYLCD 由番茄黄化曲叶病毒引起的番茄病毒病害。病害诊断参见附录A， 注：该病害的主要症状是病叶明显变小、皱缩，脉间变黄、叶缘鲜黄，叶片卷曲呈杯状或盘状，植株严重矮化，顶部形 似莱花状。 4试剂与材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682中规定的三级水。 4.1MS培养基 4.1.1MS液体培养基 称取MS干粉（M5194.43g，蔗糖30g，加水定容至1000mL，搅拌均匀并溶化后，调节pH为5.8， 于121℃高压灭菌30min，4℃下保存备用。 4.1.2MS固体培养基 称取MS干粉（M519)4.43g、蔗糖30g、琼脂粉9g，加水定容至1000mL，搅拌均匀并溶化后，调节 pH为5.8，于121℃高压灭菌30min，4℃下保存备用。 4.2YEP培养基 4.2.1YEP液体培养基 称取胰蛋白陈10g、酵母提取物10g、氯化钠5g，加水950mL，用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH 为7.0，定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min，4℃下保存备用。 4.2.2YEP固体培养基 1 NY/T 3081—2017 称取胰蛋白陈10g、酵母提取物10g、氯化钠5g、琼脂粉9g，加水950mL，用5mol/L氢氧化钠溶 液调节pH为7.0，定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min，4℃下保存备用。 4.3抗生素母液 4.3.1卡那霉素母液（50mg/mL) 称取250mg卡那霉素，溶人5mL水中后，在超净台内注入5mL的一次性注射器中，经硝酸纤维 素膜（孔径0.22μm）过滤灭菌，即得50mg/mL卡那霉素母液。分装到5个灭菌的2mL冷冻管里，每 管1mL，置2℃～8℃冰箱中保存，可使用1个月；或一20℃长期保存。 4.3.2利福平母液（50mg/mL） 称取250mg利福平于EP管中先用少量无水乙醇涡旋振荡 以溶解，再加水定容至5mL，然后在超 净台内注人5mL的一次性注射器中，经硝酸纤 孔径0.22um）过滤除菌，即配成50mg/mL利 福平母液。分装到5个灭菌的2m 可保存 3个月。 称取98.1mg乙 酮于虾 先用少 如水定 容至5mL，然后在超 净台内注入5mL 性注射斋 滤除 my 配成100mmol/L 乙酰丁香酮母液 个灭 菊的 L冷冻管里，每管1m 保存仅1个月。 4.3.4头孢噻 母液（500 mg/mL 钠 称取3g 钠先 寸和 手不 一次性 干维素膜（孔径 0.22um）过滤 即配 500.mg E 冻管里，每管 1mL。封严 在 一燥处保存不 UR 5 仪器设备 5.1高压灭菌销 灭菌温度范 :10 加热方法：电 加热器。 CU 5.2超净工作台 洁净等级 血)；平均风速： 0.25m/s~0.60 5.3恒温培养箱 人 控温范围：5℃ 5.4植物生长箱 温度范围：0℃~50℃（ 蔓容差 光照度0μmol/（m².s）~ 170μmol/（m²·s)两面光照；工作环境温度：10℃～35℃；工作时间：可定时控制或连续运行。 5.5超低温冰箱 温控范围：一60℃~一105℃；功率：1200W；噪声：<63dB。 5.6恒温摇床 回旋频率范围：30r/min~600r/min；回旋频率精度：士1r/min；摇板摆振幅度：Φ26mm；温控范 围：5℃~60℃；温度均匀度：土0.5℃；环境温度要求：5℃~30℃。 5.7冷冻台式离心机 最大容量：6mL×85mL；最高转速：30000r/min；最低转速：100r/min；温度范围：一20℃~40℃。 5.8可见分光光度计 波长范围：200nm~1000nm；波长精度：±1.0nm。 NY/T3081—2017 6对照品种与种子消毒 6.1对照品种 以Money-maker或中蔬6号等易感病的番茄品种，作为感病对照品种。 6.2种子消毒 所有番茄品种和材料的种子经灭菌水浸泡12h后，再依次经70%乙醇表面消毒30s、20%次氯酸 钠溶液（含0.1%吐温-20）浸泡15min，最后用灭菌水冲洗5次~6次，催芽播种。 7烟粉虱接种鉴定 7.1适用范围 烟粉虱接种鉴定比较简单易行,适用于基尽单位譜行较大规模的抗病性鉴定。 注：本方法较易受到烟粉虱接种虫量、 将难被烟 粉虱取食的茸毛感病番茄误 判为抗病。 7.2人工病圃建立 在防虫塑料棚或防 番茄品种幼苗5片 节有烟粉虱的番茄黄化曲 叶病毒的病株或 入俪、 内以侵 茄幼甜 小繁殖带 番茄幼苗的病情 指数超过55时 7.3番茄育苗 将消毒的 苗种子智 2517C恒温箱内黑暗条件下催 芽防发后播 盘或 育苗钵内。育 苗基质为草为 石和菜 菊（131 防虫设施栽 温度 培地里育苗 天为20℃ 26夜晚 16 番茄幼苗 片真叶充分 展开时进行折 生鉴定 7.4烟粉虱接利 将待鉴定 幼苗移 地 每1病株的带 毒烟粉虱可作 ，使病株上的 带毒烟粉虱飞至 品种或材料夏3 秋随机 列，每一重复10 株幼苗。当每株 粉虱 止接种。接种鉴 ER 定期间不得施用任 植株 行 带的肥水管理 7.5病情调查 7.5.1调查时间 接种烟粉虱后20d，每 5d调查1次感病对照番茄品种的发病情况， 情指数达到感病数值后，即 对所有待鉴定番茄植株进行病情调查， 7.5.2病情级别划分 接种植株的病情级别及其相对应的症状 快描述见表 表1 番茄抗番茄黄化曲叶病毒烟粉虱接种鉴定的病情级别划分 病情级别 症状描述 0 无可见症状 1 顶端叶片的边缘轻微黄化或卷曲 2 少数叶片的边缘或脉间轻度黄化、部分病叶轻微卷曲，顶端叶片变小 3 多数叶片的边缘或脉间重度黄化、叶缘上翘，病叶卷曲、顶端叶片显著变小，植株轻度矮化 4 整株叶片严重变小、黄化、上翘、卷曲，节间缩短，植株重度矮化，甚至停止生长 7.5.3调查方法 3 NY/T3081—2017 根据接种植株的病情级别及其相对应的症状描述，调查所有接种植株的发病情况，记载每一单株的 病情级别，并计算每份鉴定材料的病情指数（DI），取3次重复病情指数的平均值。 病情指数(DI)按式(1)计算： Z(sXn) DI = X100 .(1) NXS 式中： DI 病情指数； s 各病情级别的代表数值； n 各病情级别的植株数，单位为株； N 调查总植株数，单位为株； S 最高病情级别的代表数值。 7.6抗病性评价 7.6.1评价标准 依据待鉴定番茄3次重复的病情指数平均值确定其抗性水平，划分标准见表2。 表2番茄对番茄黄化曲叶病毒抗性的评价标准 病情指数(DI) 抗病性评价 0≤DK<15 高抗Highlyresistant（HR） 15≤D<30 抗病Resistant(R） 30≤D<55 中抗Moderately resistant(MR) 55≤D<77 感病Susceptible(S) 77≤D≤100 高感Highly susceptible(HS) 7.6.2鉴定有效性判别 当感病对照材料达到其相应感病程度（DI≥55)，该批次鉴定视为有效。 7.6.3鉴定材料处理 鉴定完毕后，喷药杀灭室内烟粉虱，并将人工病圃中所有的番茄植株及残体进行无害化处理。 7.6.4鉴定记载表格 番茄抗番茄黄化曲叶病毒鉴定结果记载表格参见表C.1。 8温室侵染性克隆农杆菌接种鉴定 8.1适用范围 本方法无需饲养烟粉虱，其操作简便、快速、准确，适用于具有番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆农杆菌 菌株的单位大规模鉴定。 8.2接种毒源 接种毒源为番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆农杆菌菌株，可参照B.2的方法自行制备，也可从相关单 位引进。 8.3制备农杆菌接种体 将冻存的番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆农杆