ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3074—2017 牛流行热诊断技术 Diagnostic techniques for bovine ephemeral fever 2017-06-12 发布 2017-10-01 实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 3074—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。 本标准主要起草人：郑福英、殷宏、刘永生、宫晓炜、陈启伟、高闪电 NY/T 3074—2017 引 言 本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时，可能涉及附录B与《牛流行热病毒间接ELISA抗 体检测试剂盒及其制备方法》相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得： PUBL IN 地址：甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号 请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利。 件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 按NY/T 543 2002《牛流行热微量中和试 行热病毒血清抗 标准中的间接ELISA方法仅可对牛流行热病毒 行定性检测，而 不能进行定量检测。 因此 本标准中的间接ELISA方法不替代NY/T 两种技术可同时 应用。 R U NY/T 3074—2017 牛流行热诊断技术 1范围 本标准规定了牛流行热的临床诊断和实验室诊断的技术要求 本标准适用于牛流行热的诊断。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T543—2002牛流行热微量中和试验方法 3生物安全措施 进行牛流行热实验室诊断时,如病毒分离、血清处理等,按照GB 19489的规定执行 4临床诊断 4.1流行特点 4.1.1以3岁～5岁壮年牛多发,奶牛、黄牛易感性最强。 4.1.2通过媒介昆虫叮咬呈病毒血症的病牛,再叮咬易感牛传播扩散，多发生于夏末秋初蚊虫活跃的 多雨季节。 4.1.3呈跳跃式传播,疫区与疫区之间交叉存在无病的清洁区。 4.1.4有一定的周期性,间隔时间为1年～7年不等。 4.1.5发病率高、死亡率低,在没有继发感染的情况下病牛多为良性经过。 4. 2 临床症状 4.2.1病牛表现为突发高热，体温高达39.5℃～42.5℃,持续2d～3d。 4.2.2病牛流泪、畏光,眼结膜充血;有鼻炎性分泌物；口腔发炎、流涎；呼吸急促、困难。 4.2.3高热期病牛食欲废绝，反台停止，瘤胃胀、蠕动停止，便秘或腹泻。 4.2.4妊娠母牛可发生流产、死胎。 4.2.5乳牛的产乳量明显降低,甚至停止。 4.3剖检病变 4.3.1主要病变在肺部，急性死亡的病例可见有明显的肺间质气肿,有些病例可见肺充血与水肿。 4.3.2淋巴结充血、肿胀;真胃、小肠和盲肠呈卡他性炎症和渗出性出血。 4.4结果判定 符合4.1流行特点,病牛出现4.2临床症状和4.3剖检病变,判为疑似牛流行热 5 实验室诊断 5.1样品采集与储存 5.1.1样品的采集 NY/T 3074—2017 选择处于发热期（体温39.5℃～42.5℃)的活畜采集样品，从其颈静脉无菌采集2管肝素抗凝血， 每管5mL～6 mL;另外,再采集 5mL～6 mL血液收集到血清管中,用于分离血清 5.1.2样品的储存 5.1.2.1样品采集后，置于冰上冷藏送至实验室。 5.1.2.22管肝素抗凝血，1管置于4℃冷藏，另外1管冻存于一80℃。 5.1.2.3将血清管稍倾斜放于37℃温箱内，保温2h;然后，3000r/min离心10min。吸取血清，转移 到另外的无菌1.5mL离心管中,冻存于一20℃。 5.2器械与设备 组织破碎仪、低温高速离心机、PCR热循环仪、核酸电泳仪和电泳槽、全自动凝胶成像系统、恒温培 养箱、洗瓶或者洗板机、酶标仪 5.3牛流行热病毒分离与鉴定 5.3.1试验材料 ARD FmL离心 灭菌（ .0 7.4PBS（见附录A中的 A.1)、牛白细胞提取液 5.3.2样品处理 取出4℃冷 白细胞，用0.5mL灭 菌pH 7.4 PBS悬浮,反复 复冻融3次，保存于一80℃备用。 EAR 5.3.3样品接种 A 5.3.3.1初代接种 5.3.3. 1.1 将上述制备 的白细胞悬液5000/min离心5min，用微量进样器吸 及取50 L 二清液，脑内 接种1日龄 3 龄 BALB/ 即可。 5. 3. 3. 1. 2 设立对照组 10 只,每只接种10 μ pH 7 C 5. 3. 3. 1. 3 接种 种后每问隔2 h 观察 1次,弃去 24 h 内死亡的乳鼠;及时收集 24 h死 亡的乳鼠，冻存在 立颈处死，做无害化处理。 Z 一80℃。接种后 d仍然存活的 5.3.3.2传代接 R 24h后列 并剥离，暴露出整个 骨。 5.3.3.2.2 用另一把无菌剪刀剪开乳鼠骨,并取出 0.1g～0.3g 脑组织,放, <5mL容量的灭菌离心 管中,在天平上称量所取脑组织的重量(在加人脑组织前需称量离心管的重量 5.3.3.2.3以 1：5(W/V)加人灭菌 pH 7.4 PBS,在组织破碎仪内以 50 Hz研磨1min,10000r/min 离心10min，取上清再接种乳鼠。如此盲传3代 5.3.4观察结果 第1代接种乳鼠在接种后10d～12d死亡,死前无明显症状。第2代接种乳鼠在接种后5d～7d 死亡,死亡前表现后腿麻痹，常倒向一侧。从第3代开始,接种乳鼠在接种后3d～5d有规律地集中死 亡,死前主要表现为神经症状,颤抖,后腿麻痹,步态不稳，常倒向一侧,皮肤痉挛性收缩，多数经1d～ 2d死亡。 5.3.5病毒鉴定 将盲传至3代～5代的乳鼠脑组织，按照5.3.3.2的步骤处理，取上清，参照5.4做进一步鉴定。 5.3.6结果判定 接种乳鼠出现临床神经症状,并且参照5.4鉴定结果阳性,判定为牛流行热病毒分离阳性；否则,判 2 NY/T 3074—2017 定为牛流行热病毒分离阴性。 5.4 RT-PCR方法 5.4.1试验材料 去离子水、DEPC水、病毒 RNA提取试剂盒、一步法 RT-PCR试剂盒、DL 2000 DNA分子质量标 准、琼脂糖、TAE缓冲液、引物(浓度为25pmol/μL）。相关溶液的配制方法见附录A。 可以采用引物420F/420R用于牛流行热病毒核酸的检测，引物的靶基因、序列和扩增产物的大小 见表1。 表 1RT-PCR检测牛流行热病毒核酸的引物 引物 目的 靶基因 序列(5'-3')） 产物大小 420F 正向引物 糖蛋白(G)基因 AGAGCTTGGTGTGAATAC CCAACCTACAACAGCAGA 420 bp 420R 反向引物 糖蛋白(G)基因 5.4.2RNA提取 含有牛流行热病毒的肝素抗凝血(冷藏或冻存的均可)作为阳性对照样本,采自健康牛(未感染牛流 行热病毒或接种牛流行热病毒疫苗)的抗凝血作为阴性对照样本。用病毒 RNA提取试剂盒从阳性对 照样本、阴性对照样本和待检样本中提取病毒RNA，提取步骤按照试剂盒说明书进行。提取的病毒 RNA立即进行RT-PCR扩增或冻存于一80℃备用。 5.4.3RT-PCR反应 5.4.3.1用商品化一步法RT-PCR试剂盒进行扩增，反应体系为50μL。按照说明书配制试剂盒中 的各种成分,再加人1μL正向引物420F、1μL反向引物420R、5μLRNA模板，用DEPC水补足至 50 μL。 5.4.3.2每次进行RT-PCR反应时均设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照用阳性对照样 本的病毒RNA作为模板,阴性对照用阴性对照样本的病毒 RNA作为模板,空白对照用DEPC水作为 模板。 5.4.3.3RT-PCR扩增程序为:50℃30min,94℃ 2min,35个循环（94℃20 s,46℃1min，72℃ 30 s),最后 72℃ 10 min。 5.4.4RT-PCR产物的电泳 RT-PCR反应结束后,取RT-PCR产物8μL、DL2000分子质量标准5μL,在1%琼脂糖凝胶中 进行电泳。以100mA电泳20min,然后用凝胶成像系统观察结果并拍照保存。 5.4.5质控标准 阳性对照出现一条420bp的特异性扩增条带，阴性对照和空白对照无420bp的扩增条带，说明试 验成立。 5.4.6结果判定 被检样品出现一条420bp的特异性扩增条带,判为RT-PCR结果阳性,判定检出牛流行热病毒核 酸。被检样品无420bp的特异性扩增条带,判为RT-PCR结果阴性,判定未检出牛流行热病毒。 5.5间接ELISA方法 5.5.1试验材料 牛流行热病毒重组G蛋白抗原（制备方法见附录B)、标准阳性对照血清（制备方法见附录C)、标准 阴性对照血清（制备方法见附录D)、商品化辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗牛IgG抗体、血清稀释液、 TMB底物溶液、包被液、封闭液、PBST洗涤液、终止液、一次性封板膜、酶标板。相关试剂的配制方法 见附录E。 5.5.2操作步骤 3 NY/T 3074—2017 5.5.2.1抗原包被 用包被缓冲液将牛流行热病毒