ICS 65.020 B 15 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2916—2016 棉铃虫抗药性监测技术规程 Code of practice of insecticide resistance monitoring of Helicoverpa armigera(Hibner) 2016-10-26 发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 2916—2016 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、南京农业大学、江苏省植物保护站、山东省植物保护 总站。 本标准主要起草人：张帅、吴益东、张浩男、杨亦桦、武淑文、鞠国钢、宋姝娥。 I NY/T 2916—2016 棉铃虫抗药性监测技术规程 1范围 本标准规定了棉铃虫[Helicoverpaarmigera（Hubner)]抗药性监测的基本方法。 本标准适用于棉铃虫对常用杀虫药剂及苏云金芽孢杆菌[Bacillusthuringiensis]杀虫晶体蛋白 CrylAc 的抗性监测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 浸叶接虫法 leaf-dipping bioassay 将浸过药液并晾干的常规棉花叶片放在底部平铺琼脂凝胶的24孔培养板内，使棉铃虫2龄初幼虫 接触和取食带药叶片的生物测定方法。 2. 2 毒素涂表法surface contamination bioassay 将经磷酸缓冲液溶解的Cry1Ac蛋白均匀涂布到底部平铺棉铃虫人工饲料的24孔培养板表面，使 棉铃虫2龄初幼虫取食饲料表面杀虫蛋白的生物测定方法。 3仪器设备 3.1电子天平(感量0.1mg）。 3.2打孔器（直径与24孔组织培养板孔径相同）。 3.3诱虫灯。 3.424孔培养板（内径15.6mm）。 3.5微波炉。 3.6电磁炉。 3.7 移液器(5mL、1mL)。 3.8连续分液器(5mL)。 3. 9 量筒(500 mL)。 3. 10 烧杯(10mL、25mL、100mL、500mL)。 3.11人工气候箱：温度（26士1)℃、相对湿度（RH)（60士10)%、光照周期16h：8h(L：D)。 4试剂与材料 4.1生物试材 4.1.1试虫 棉铃虫2龄初幼虫（初孵幼虫完成第一次蜕皮后12h以内，虫体为黑色，体重范围为1.0mg～1.5 mg)。 4.1.2供试植物 常规棉花（不含Bt基因或其他抗虫基因）。 1 NY/T 2916—2016 4.1.3试验人工饲料 配方参见附录A。 4.2试验药剂 4.2.1杀虫剂原药 4.2.2Cry1Ac原毒素及 Cry1Ac活化毒素 CrylAc原毒素制备自苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种HD-73菌株；Cry1Ac原毒素与胰蛋白酶 （Sigma，T-8642)按照蛋白含量20：1比例于37℃水浴2h，制备Cry1Ac活化毒素。制备不同批次的 Cry1Ac原毒素与活化毒素均需通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测毒素的纯度（原毒素分子量为130 ku，活化毒素分子量为65ku），并进行效价检测（在1μg/cm²剂量下对棉铃虫室内敏感品系的杀虫效果 应>99%)。 5 试验步骤 5.1试虫采集与饲养 利用诱虫灯从植棉区棉田诱集 成 50对以 卵粒； 或从植棉区棉田 室内用 随机采集棉铃虫卵 500 粒以之，在 以各种群的F 测定的虫源。 5.2药液配置 准确称取 虫剂原药 用丙酮或其他合适的有 机溶剂溶解 m/用量的 TritonX-100，配制成母液 备用。 将 Cry1Ac原毒素和活化毒素溶于0.01mol/LpH7.4的磷酸缓冲液,配 衣度的母液备用。 5.3处理方法 R U 5.3.1浸叶接虫法 采集未接触任 令期顶部展开的第 径 与24孔组 织培养板孔径相同 水溶 按照等日 度配制 个～7个系 列浓度，把圆叶 人药液 s后正面朝上放置在吸水纸 将晾干 的带药 标记好的24孔 组织培养板内(培 琼脂水溶 后备用 每个圆叶片正 面向上放置，每孔接 头经 h的2 龄初幼虫。每个浓度处理48头,并 设不含 任何药剂的0.1% Triton X-100水溶 液 养板盖以防止试 虫逃逸。 5.3.2毒素涂表法 移取60℃左右的人工饲料至24孔培养板孔底， 经轻摇晃至 面平整，孔壁、孔口不得 粘结饲料，室温下自然凝结：将 1Ac原毒素或活化毒素用0.01 mol/ 7.4的磷酸盐缓冲液按等 比梯度稀释成5个～7个浓度梯度；待饲料冷却固化后，每孔加入10 uL的毒素溶液到饲料表面，置于 室温下晾干；在24孔培养板中每孔接入1头经饥饿4h的2龄初幼虫。每个浓度处理48头，并设不含 任何药剂的0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液作为空白对照；接虫后的培养板用两层黑色棉布覆盖 后再盖上培养板盖以防止试虫逃逸。 5.4结果检查 接虫后的培养板置于恒温光照培养箱［（26土1)℃,RH（60士10）%，16h：8h(L：D)饲养。 对于化学杀虫剂，需根据药剂作用特点来确定处理后检查死亡虫数的时间，如拟除虫菊酯类、有机 磷类、氨基甲酸酯类、双酰胺类等杀虫剂处理48 h后检查结果;对于杀虫作用较慢的药剂如甲氨基阿维 菌素苯甲酸盐、多杀菌素、氟啶脲等杀虫剂处理72 h后检查结果。用毛笔轻触虫体，试虫不能正常爬行 即视为死亡。 对于Cry1Ac原毒素和活化毒素，处理120h后检查结果。完全死亡或生长发育受到严重抑制（体 2 NY/T 2916—2016 重小于5mg)即视为死亡。 6数据统计与分析 6.1死亡率计算方法 根据检查数据，计算各处理的校正死亡率。按式（1)和式（2)计算，计算结果均保留到小数点后 两位。 Pi = 式中： P1 死亡率,单位为百分率(% K N 每处理浓度总中 (2) 式中: P2 单位为百分率 P, 单位为百分率(%) P。 照死亡 ，单位为百分率（%） 对照死亡 率在10 6以下。 6.2 回归方程和致死中浓度(LCso)计算方法 采用机 析法,求出每个药剂的 LC 标准误。 7抗药性水 平的计 算与评估 7. 1 棉铃虫对部分杀虫剂的敏感性基线 参见附 B 7.2抗性1 根据敏感品 系地 测试种 样的抗 性倍数。 M (3) 人 式中: RR -测试种群的抗性倍数； T 测试种群的 S 敏感品系的L 7. 3 抗药性水平的评估 根据抗性倍数的计算结果，按照表1中抗药性水平的分级标准，对测试种群的抗药性水平做出 评估。 表1抗药性水平的分级标准 抗药性水平分级 抗性倍数(RR)，倍 低水平抗性 5.0<RR≤10.0 中等水平抗性 10. 0<RR≤100. 0 高水平抗性 RR>100.0 NY/T 2916—2016 附录A (资料性附录) 棉铃虫人工饲料配方 A.1麦胚粉1200g，大豆粉400g，加水4000mL，放人灭菌锅煮熟（第一次上汽后30min即可，断电后 放汽使气压回到正常值）。 A. 2 2山梨酸10g，酵母粉120g,青霉素2g(100万单位/g),对羟基苯甲酸甲酯20g,维生素C40g，肌 醇2g，微量元素组合342.9mg，混入凉开水中搅拌均匀待用（约200mL）。 微量元素混合物（342.9mg） 盐酸硫胺素（Thiaminehydrochloride） 26. 2 mg 盐酸吡多辛(Pyridoxine hydrochloride) 26. 2 mg 泛酸钙(Calcium pantothenate) 104.3 mg 烟酰胺(Nicotinamide) 104.3 mg 钴胺素(Cobalamin,vitamin Bi2) 0. 6 mg 核黄素(Riboflavin) 52. 5 mg 叶酸(Folic acid) 26.2 mg 生物素（Biotin) 2.6 mg A. 3 3²琼脂100g，加水2000mL，微波30min至完全融化， A.4将饲料拿出后，稍放凉，加人琼脂搅匀，放凉至60℃左右即可加人A.2配好的溶液及16mL甲 醛,搅拌均匀后倒入相应的容器内。 A.5 5待饲料冷却后盖上保鲜膜，置于4℃冰箱保存。 A. 6 6若制备的饲料用于生物测定，完成步骤A.1～A.4,将搅拌均匀的饲料放在加热器上加热，可根据 需要加人适量开水。移取饲料至24孔培养板孔底，每孔900μL，轻轻摇晃至液面平整，孔壁、孔口不粘 结饲料，室温自然凝结备用。 4 NY/T 2916—2016 附录B （资料性附录） 棉铃虫对部分杀虫剂及 Cry1Ac毒素的敏感性基线 B. 1 棉铃虫对部分杀虫剂的敏感性基线 见表B.1。 表 B. 1 棉铃虫对部分杀虫剂的敏感性基线 药剂名称 斜率士标准误 LCso（mg/L)（95%置信限） 氯氰菊酯 1.64±0.19 3.52(1. 63~6. 71) 氯氟氰菊酯 1.07±0.16 1. 38(0. 67~2. 23) 辛硫磷 2.07±0.33 3.51(2.41~4.64) 丙溴磷 1.95±0.21 17.62(6.91~46.48) 多杀菌素 1.78±0.19 1.27(0. 97~1. 68) 溴虫腈 1.98±0.21 2.77(2.15~3.59) 虫威 1.64±0.21 1.71(1.22~2.30) 氯虫苯甲酰胺 1.40±0.16 0. 17(0. 11~0. 24) 甲氨基阿维菌素苯甲酸盐 1.37±0.15 0.00051(0.000 36~0.000 69) 氟啶脲 1.61±0.17 4. 54(1.90~10.02) 注：敏感品系