ICS 65.120 NY B 46 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2896—2016 饲料中斑螯黄的测定 高效液相色谱法 Determination of canthaxanthin in feeds- High performance liquid chromatography 2016-05-23 发布 2016-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 2896—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：华中农业大学、广州汇标检测技术中心、广州立达尔生物科技有限公司、帝斯曼 (中国）有限公司。 本标准主要起草人：齐德生、张妮娅、陈雷、高思。 I NY/T 2896—2016 饲料中斑螯黄的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了饲料中斑螯黄测定的高效液相色谱方法。 本标准适用于预混合饲料添加剂、浓缩饲料及配合饲料中斑螯黄的测定。本标准方法的检出限为 0.16mg/kg，定量限为0.4mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料样品的制备 3原理 试样中的斑螯黄经无水乙醇和二氯甲烷提取，经氮保护浓缩后重溶，注人高效液相色谱仪中进行分 离，紫外检测器检测，外标法测定样品中斑螯黄的含量。 4试剂和材料 除特别说明外，所有试剂均为分析纯试剂，试验用水符合GB/T6682中三级用水规定，色谱用水符 合GB/T6682中一级用水规定。 4.1正已烷。 4.2二氯甲烷。 4.3无水乙醇。 4.4丙酮。 4.5甲苯。 4.6正已烷-丙酮溶液（93十7)：将正已烷和丙酮按照体积比为93：7混合均匀。 4.7斑螯黄标准品：canthaxanthin,CAS为514-78-3,纯度大于90%，于4℃避光贮存。 4.8斑螯黄标准储备液：称取20mg斑螯黄标准品于100mL棕色容量瓶中，先加入20mL甲苯，室温 条件下放人超声波清洗仪中辅助溶解15min，后用正已烷定容至刻度，得到浓度为200ug/mL的斑螯 黄标准储备液。 4.9斑螯黄标准工作液：准确移取斑螯黄标准储备液（4.8），用正已烷准确稀释成浓度为5μg/mL的 标准工作液，即配即用。 5仪器 5.1分析天平：感量0.0001g。 5.2高效液相色谱仪：配有紫外检测器。 5.3氮吹仪。 5.4超声波清洗仪。 NY/T 2896—2016 5. 5 50.45um微孔滤膜。 5.6分析实验室常用玻璃仪器。 6试样的采集与制备 按GB/T14699.1采集有代表性的样品，用四分法缩减取样。按GB/T20195进行制备样品。粉 碎后过0.45mm孔径的试验筛，混合均匀，装入密闭容器中，低温保存备用。 7 分析步骤 7. 1 试样溶液的制备 称取5g(m)左右试样，精确到0.000 40mL 元水乙醇，摇匀，加人40mL 二氯甲烷，放在50℃超声波水浴锅 惠纸过滤至 100mL（Vi）容量瓶中， 于避光处用二氯甲烷定 5. 虑液于 气吹干。残余物用 2.0mL(Vs）正已烷-丙酮溶 广溶解，后用 um行 微力 ，制得试样溶液。以上 操作均在避光通风柜内进行。 7.2色谱参考条 检测器：紫外检测 色谱柱：正相硅胶 50mm，内径 mm,粒 流动相：正 烧 丙酮溶 液(93+7) 流速：1.5mL minA R 进样量：20 检测波长： nm 466 柱温：25℃ C 7.3测定 分别取20L斑 标准工作液和试样溶液，在高效液相色谱仪 测定斑黄 葉的峰 锋面积，根据峰面 积计算滤液中斑螯黄白 的浓 斑螯黄标准溶 液的 色谐 8 结果计算 K 饲料中斑螯黄含量X 质量分数【毫克每千克（mg/） /kg）门表示，按式 (1)计 AX (1) XV, 式中： X 样品中斑螯黄的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； A 试样溶液中斑黄的峰面积； C 斑螯黄标准工作液的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）； V3 用于重溶浓缩残余物的正已烷-丙酮溶液体积，单位为毫升（mL）； Vi 试样提取液总体积，单位为毫升（mL）； A 标准工作液中斑黄的峰面积； V2 用于浓缩的提取液体积，单位为毫升（mL）； m 称样量，单位为克（g）。 测定结果用两次平行测定后的算术平均值表示，计算结果保留一位小数。 2 NY/T 2896—2016 9重复性 在重复性条件下获得的两次独立测定结果与这两个测定值算术平均值的绝对差值，在测定结果小 于或等于15mg/kg时，不大于该平均值的15%；测定结果大于15mg/kg时，不大于该平均值的10%。 AGRI NY/T 2896—2016 附录A (资料性附录) 斑黄标准溶液高效液相色谱图 斑螯黄标准溶液（2ug/mL)高效液相色谱图，见图A.1 mV 检测器A:466nm 40 30 斑螯黄 20 Fol Fo FO1- -20 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min 图A.1 斑螯黄标准溶液(2ug/mL）高效液相色谱图 NY/T 2896—2016 附录A (资料性附录) 斑黄标准溶液高效液相色谱图 斑螯黄标准溶液（2ug/mL)高效液相色谱图，见图A.1 mV 检测器A:466nm 40 30 斑螯黄 20 Fol Fo FO1- -20 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min 图A.1 斑螯黄标准溶液(2ug/mL）高效液相色谱图