ICS65.020.01 CCSB21 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2745—2021 代替NY/T2745—2015 水稻品种真实性鉴定 SNP标记法 Rice(Oryza sativa L.)variety genuineness identification- SNP based method 2021-12-15发布 2022-06-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T2745—2021 厂食典通 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文化的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件代替NY/T2745—2015《水稻品种鉴定SNP标记法》，与NY/T2745—2015相比，除结构调 整和编辑性改动外，主要技术变化如下： a）推荐了分别用于品种真实性验证和身份鉴定的SNP位点组合及其相应的分型方法； b）增加了结果报告。 本文件由农业农村部种业管理司提出。 本文件由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37)归口。 本文件起草单位：中国水稻研究所、中国科学院分子植物科学卓越创新中心、全国农业技术推广服 务中心。 本文件主要起草人：魏兴华、刘丰泽、韩斌、徐群、冯旗、赵妍、支巨振、周泽宇、杨窑龙、冯跃、任雪贞、王 珊、章孟臣。 I NY/T2745—2021 水稻品种真实性鉴定 SNP标记法 范围 本文件规定了利用SNP标记法进行水稻（Oryza sativaL.）品种鉴定的术语和定义、缩略语、原理和 总则、试验条件、试剂和材料、仪器设备、样品、检测程序、结果计算与表示和结果报告。 本文件适用于水稻品种的真实性验证、真 生身份鉴定， 也适用于品种关系鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过 中，注日期的引用文件，仅 该日期对应的版本适用于 文件 不注日两的号作 斤有的修改 文单)适用于本文件。 GB/T3543.2农作物种 GB/T6682 3术语和定义 适用 下列术语和定 3. 1 单核苷酸多态性 siugl nucleotidepolymorphism 在基因组水 单上核 3. 2 U 品种真实性验 Ivarie 与其对应品 称的标准样品 证 标准样品的 情况下，可用对照样 进行 3. 3 品种真实性身份 ariet dentification 通过与标准样品 或筛查比较确定供检样品的真实品 3. 4 人 标准样品 standard sample 国家指定机构保存的具有法定身份的代表品种特征特性的实物种子或DNA 样品。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide）。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）。 KASP：竞争性等位基因特异性PCR（kompetitiveallelespecificPCR）。 PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）。 5原理和总则 5.1原理 水稻不同品种的基因组存在着能够世代稳定遗传的单核苷酸多态性（SNP)差异，利用SNP差异，通 过与标准样品DNA指纹数据比对或筛查的方式，进行品种真实性验证和品种真实性身份鉴定。 5.2总则 1 NY/T2745—2021 5.2.1应依据“适于检测目的”的原则，统筹考虑检测规模和检测能力，择定适宜的检测平台、引物或探 针、样品数量，经过验证，制定相应的检测方案；品种真实性验证依据SNP位点差异数目进行判定，品种真 实性身份鉴定依据SNP位点相似度进行判定。品种关系鉴定可采用品种真实性身份鉴定的检测方案 5.2.2本文件避选了96个SNP位点用于品种真实性验证，引物信息、等位变异、参照样品信息及位点信 息详见附录A。50420个SNP位点用于品种真实性身份鉴定，位点信息详见种业大数据平台。品种真实 性验证允许采用序贯方式检测，若检测到可排除两者为同一品种的差异位点数的，可终止检测。 5.2.3本文件推荐了基于KASP技术的荧光原位扫描和基于激光微刻SNP芯片分型2个检测平台。 9 试验条件 真实性鉴定应在有利于检测正确实施的控制条件下进行，包括但不限于下列条件： 种子检验人员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能； 所有仪器与使用的技术相适应，并已经过定期维护、验证和校准； 使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材； 使用校准检测结果评定的适宜参照样品。 7试剂和材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。 7.1DNA提取 7.1.1 CTAB[C1H33(CH3)3NBr,CAS号:57-09-0]。 7. 1. 2 三氯甲烷（CHCl3，CAS号：67-66-3）。 7.1.3异戊醇(CsH12O,CAS号：123-51-3)。 7.1.4异丙醇(C,HsO,CAS号：67-63-0)。 7. 1.5 乙二胺四乙酸二钠（CloHNzNa2O：·2H2O,CAS号：139-33-3)。 7. 1. 6 三羟甲基氨基甲烷[NHC(CH2OH)，CAS号：77-86-1]。 7.1.7 氢氧化钠（NaOH,CAS号：1310-73-2）。 7.1.8 氯化钠（NaCI,CAS号：7647-14-5）。 7.1.9无水乙醇（CHCH2OH,CAS号：64-17-5）。 7. 1. 10 ）盐酸（HCl,CAS号：7647-01-0）。 7.1. 11 β-巯基乙醇（CzHOS,CAS号：60-24-2)。 7.2SNP基因分型 7.2.12 2XPCR MIX。 7.2.2引物工作液。 7.2.3 定制芯片及配套试剂。 8 仪器设备 8.1 高速冷冻离心机：转速≥12000r/min。 8.2微量移液工作站或微量移液器。 8.3水浴锅或干式恒温金属浴：20℃~100℃ 8.4紫外分光光度计：波长定点扫描230nm、260nm和280nm。 8.5 组织研磨仪。 8.6分析天平：感量为0.01g。 8.7 pH计。 2 NY/T2745—2021 8.8 涡旋混合器。 8.9高压灭菌锅。 8. 10 PCR扩增仪或水浴PCR扩增装置。 8.11 荧光原位扫描系统：3色及以上荧光。 8. 12 烘箱：20℃~100℃控温精度土2℃。 8.13 芯片扫描仪及其配套相关仪器设备：能检测5万个及以上位点。 8.14 杂交箱：20℃~100℃。 8. 15 板式离心机：4℃，最大离心力3500g 8.16 摇床。 9样品 PUBLI IS 9.1送验样品可为种子 应 合GB/T3543.2的规 定。送验样品如为种子 不少 德 等组织或器官，样品 应至少来自30个植 个体 9.2试验样品应至 合检测或单个个体 10 检测程序 10. 1 引物/探针合成 根据真实性 的需求选择相 R 10.2DNA提取 10.2.1 DNA质量 要求 DNA提取 立保证 增的要求 外光吸光度 OD260与OD280的 宜介 为推存的 约DNA提取 方法都适用于本 C 10.2.2CTAB法 取试样的胚、肝 Hig 管加落 磨，或取种子充 C预热的CIAB提取液 分磨碎后移入2.0m 混匀，65℃水浴 30min。其间轻微颠佳 人每 等体积的 甲烷/异戊醇（） K 充分混合后静置 10min，在12000r/mim 10mm 吸取主 青液转移至新的离心管中 ，加人 积预冷的异丙醇，轻轻 颠倒混匀，一20℃放置30 后在4 mm离心 min。弃上清液，加入70%乙醇，洗涤2 nn r/ 遍，自然条件下干燥，加人100 充分浴解店 共备用 液配置见附 10.3SNP基因分型 10.3.1荧光原位扫描检测 10.3.1.1PCR扩增 PCR反应可以在不同规格的PCR板或膜上进行，反应体系的总体积和各组分体积按照表1进行配 制，每板设空白对照，试验过程中设2个参照样品。 表1基于微孔板或微量反应孔膜平台的PCR反应体系 96微孔板 384微孔板 1536微孔板 微量反应孔膜 微孔板类型 μL μl, μL μL DNA模板（20ng/μL) 1. 5 1.5（烘干） 1.5（烘干） 1.6（烘干） 2XPCR MIX 5 1. 5 0. 5 0.8 引物工作液 0.140 0.042 0. 014 0.024 双蒸水 3.36 1. 5 0. 5 0.776 总反应体积 3 1 1. 6 3 NY/T2745—2021 PCR扩增反应程序： a)94℃15min; b）94℃20s，61℃60s，以0.6℃/循环的速度降落，10次循环； c）94℃20s，55℃60s，26次循环； d）若初始反应结束检测不到荧光信号或荧光信号弱，可继续94℃20s，57℃60s，3次循环。 10.3.1.2荧光扫描 利用荧光原位扫描系统（8.11)对PCR扩增产物进行基因分型，空白对照没有扩增信号或者扩增信号 较弱，且参照样品等位变异与附录A的等位变异一致时，采集基因分型数据。 10.3.2SNP芯片扫描检测 10.3.2.1DNA扩增、片段化、沉淀 a）变性：DNA模板8.7μL,每孔加8.7μL的变性试剂，室温放置10min； b) 中和：每孔加56.6L中和试剂； 扩增：每孔加100.1μL扩增试剂，37℃孵育（23士1）h； 终止扩增反应：将样品板从37℃杂交取出，放入65℃杂交炉，孵育20min，然后放入37℃杂交 炉，孵育45min； e） 片段化：每孔加24.8μL片段化预混试剂，37℃孵育30min；