ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2744-2015 马铃薯纺锤块茎类病毒检测 核酸斑点杂交法 Detection of potato spindle tuber viroid(PSTVd)- Nucleic acid spot hybridization(NASH) 2015-05-21 发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 27442015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨）、中国农业科学院植物保 护研究所、黑龙江八一农垦大学。 本标准主要起草人：邱彩玲、刘尚武、张志想、吕典秋、白艳菊、李世访、王绍鹏、魏琪、董学志、耿宏 伟、万书明、金光辉、高艳玲、郭梅、闵凡祥、王亚洲、杨光辉、王晓丹、申宇、张威、范国权、张抒、宿飞飞、李 勇、胡林双、马纪、刘振宇、高云飞、杨帅、李学湛。 I NY/T 2744—2015 马铃薯纺锤块茎类病毒检测核酸斑点杂交法 1范围 本标准规定了马铃薯纺锤块茎类病毒(PotatoSpindleTuberViroid，PSTVd)的检测方法。 本标准适用于马铃薯的马铃薯纺锤块茎类病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB7331马铃薯种薯产地检疫规程 GB18133马铃薯种薯 NY/T1962-2010马铃薯纺锤块茎类病毒检测 3原理 经过标记的PSTVd探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显 影或显色反应检测特异结合的探针，鉴定马铃薯组织是否感染PSTVd。 4试剂与材料 以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682中规定的一级水。 4.1CHCl3（三氯甲烷）。 4.2正电荷尼龙膜（Hybond-N十）。 4.3抗地高辛-AP(Anti-Digoxigenin-AP)。 4.4CDP-Star(化学发光法使用）。 4.5X光片（化学发光法使用）。 4.6显影液、定影液（化学发光法使用）。 4.7Tween-20(Cs8H14O26，聚氧乙烯去山梨醇单月桂酸酯）。 4.8杂交液。市售。 4.910×阻断液。市售。 4.10提取缓冲液。在160.0mL蒸馏水中依次加人NaCl11.7g、MgCl2²0.4g、醋酸钠（CH:COONa) 8.21g、无水乙醇40.0mL和十二烷基磺酸钠（SodiumDodecylSulfate，SDS）6.0g，用HCl或NaOH 调节pH至6.0。 4.1120倍柠檬酸缓冲液储备液（20×SSC储备液）。在800mL水中加人NaC1175.3g、柠檬酸钠 88.2g，加人数滴10mol/LNaOH溶液调节pH至7.0,加水定容至1L，分装后高压灭菌。或者选择市 售商品。 4.1210%SDS。在80mL水中加人SDS10g，溶解后定容至100mL。 4.132×SSC/0.1%SDS。在35.6mL蒸馏水中加入20倍柠檬酸缓冲液储备液（4.11）4mL，10% SDS(4.12)400μL,混匀。 1 NY/T 2744—2015 10%SDS(4.12)400uL，混匀。 4.15马来酸缓冲液。在800mL水中加入马来酸（顺丁烯二酸，C4H4O）11.607g，NaCl8.77g，用 NaOH调pH至7.5(20℃），定容至1L，5℃～25℃稳定。 4.16洗涤缓冲液。在100mL马来酸缓冲液（4.15)中加入0.3mLTween-20(4.7），混匀，5℃~25℃ 稳定。 4.175X检测缓冲液。在80mL水中加人Tris-HCl7.88g,NaCl2.92g,用HCl或NaOH调节pH 至9.5（20℃），定容至100mL。使用时用水稀释至1×工作液，5℃～25℃稳定。 4.18探针。参考吕典秋或其他相关文献制备，或直接购买商品化的探针。 4.19阻断液。用马来酸缓冲液（4.15)稀释10×阻断液（4.9），制成1×工作液。如：2mL10×阻断液 十18mL马来酸缓冲液，现用现配。 4.20抗体液工作液。每次使用前，需要10000r/min离心抗Dig-AP（4.3）5min，从表面小心吸取 所需的量，用阻断液按1：5000稀释抗体液。例如：2μuL抗Dig-AP+10mL阻断液（4.9），2℃～8℃保 存，12h稳定。 4.21二甲基甲酰胺(C.H,NO,DMF)。 4.22硝基蓝四氮唑(C4oH3oNioO。·2Cl,NBT)储备液（化学显色法使用）。NBT 30mg十DMF 70% 1mL，4℃或一20℃保存备用。 存备用。 4.24显色液（化学显色法使用）。加NBT储液（4.22）和BCIP储液（4.23）各10μL于1mL1×检测 缓冲液中，混匀，现用现配。 4.25发光底物（化学发光法使用）。10μLCDP-STAR（4.4）加人到1mL1×检测缓冲液中，混匀。 5仪器 5.1紫外交联仪。 5.2台式低温高速离心机（≥10000r/min，4℃）。 5.3杂交箱。 5.4水平摇床。 0000000200) 5.6天平仪、灭菌锅、暗盒（化学发光法）等。 6分析步骤 6.1阴阳对照的设立 设立阳性对照和阴性对照。在以下实验过程中，要设立阴性、阳性对照，即标准的阳性样品和阴性 样品要同待测样品一同进行如下操作，阴阳对照的制备方法参见附录A。 6.2样品的采集和制备 样品采集按照GB18133和GB7331中的规定进行。 6.3样品RNA的提取 取0.2g样品放于研样袋或研钵中，加入0.3mL提取缓冲液（4.10），磨碎，转入1.5mL离心管中， 盖严盖，37℃孵育15min，加人等体积（0.3mL）的三氯甲烷（4.1），振荡离心管或涡旋震荡使之彻底混 匀，直至出现乳状液，4℃，10000r/min离心5min，至溶液分离（上层水相，下层三氯甲烷，或把离心管 放在4℃冰箱过夜，分离RNA），吸出上清液，4℃保存，备用。 2 NY/T 2744—2015 或者选择市售商品化RNA提取试剂盒，完成RNA的提取。 6.4点样及固定 用移液器吸取2μL～3μLRNA溶液（6.3），点在提前画好方格的尼龙膜上，室温干燥后，将尼龙膜 放在紫外交联仪上正反面各交联1min，能量为1200J。 6.5杂交 根据尼龙膜的大小取相应体积的杂交液（大约4mL杂交液/100cm²尼龙膜），加人变性过的探针 （5ng/mL～20ng/mL杂交液），混匀，将固定好的尼龙膜放入杂交管中，排除气泡，于68℃，8r/min～ 15r/min，杂交过夜。 6.6洗膜 用镊子取出尼龙膜，放人装有20mL2×SSC，0.1%SDS溶液（4.13)的平皿中，在室温下振荡洗涤 2次，每次5min；用镊子将尼龙膜转人0.1×SSC0.1%SDS溶液（4.14）（先50℃预热），55℃水浴振荡 洗涤2次，每次15min（也可以在杂交管中用最大转速洗涤）；将尼龙膜取出转人装有20mL洗涤缓冲液 （4.16）的平皿中振荡洗涤5min。 6.7孵育 在20mL～30mL阻断液（4.19）中孵育30min；在10mL抗体液（4.20）中孵育30min；在20mL~ 30mL洗涤缓冲液（4.16）中洗涤2次，每次15min；在15mL检测缓冲液（4.17）中平衡2min~5min。 所有孵育过程应在15℃～25℃下搅拌进行。 6.8信号检测 可采用下列方法之一进行信号检测。 6.8.1化学发光检测反应 将尼龙膜夹在两层保鲜膜中间，将上层保鲜膜提起，沿尼龙膜的左边加人适量新鲜配制的发光底物 液（4.20），然后缓慢放下上层保鲜膜，使底物均匀的覆盖膜表面。于室温静置作用5min。 用镊子夹住膜的边缘轻轻提起，让多余的底物流出，并用滤纸吸干膜外的底物液，在暗室中用X光 片压片并进行曝光、显影、定影。 6.8.2化学显色检测反应 复印备存。 7结果判定 7.1化学发光检测反应 X光片上对应点样位置出现斑点者为马铃薯纺锤块茎类病毒阳性样品，参见B.1。如果检测结果 的阴性样品没有特异性斑点，阳性样品有特异性斑点时，则表明此次反应正确可靠，如果检测的阴性样 品出现特异性斑点，或阳性样品没有特异性斑点，说明在RNA样品制备或杂交反应中的某个环节存在 问题，需重新进行检测。 7.2化学显色检测反应 尼龙膜上对应点样位置出现蓝紫色斑点者为马铃薯纺锤块茎类病毒阳性样品，参见B.2。如果检 测结果的阴性样品没有特异性斑点，阳性样品有特异性斑点时，则表明此次反应正确可靠，如果检测的 阴性样品出现特异性斑点，或阳性样品没有特异性斑点，说明在RNA样品制备或杂交反应中的某个环 节存在问题，需重新进行检测。 3 NY/T 2744—2015 附录A (资料性附录) PSTVd阴阳对照参考制备方法 A.1试样来源 田间采集具有植株矮化、叶片皱缩、块茎龟裂、畸形等马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd)症状的马铃 薯样品和健康的马铃薯样品。 A. 2 2测定步骤 A.2. 1PSTVd阴阳对照的鉴定 采用NY/T1962一2010中规定的方法检测上述样品，将马铃薯纺锤块茎类病毒特异性条带回收、 测序，并进行BLAST比对，确定为PSTVd的样品进行隔离种植或试管苗继代保存；经检测为阴性的马 铃薯样品同样处理。 A.2.2 2PSTV