ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 27432015 甘蔗白色条纹病菌检验检疫技术规程 实时 荧光定量PCR法 Technical regulations for inspection and quarantine of Xanthomonas albilineans (Ashby)Dowson-Real time PCR method 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 2743-2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草， 本标准由农业部种植业管理司提出。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)归口。 本标准起草单位：农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室、农业部甘及制品质量监督检验 测试中心、国家甘蔗工程技术研究中心。 本标准主要起草人：许莉萍、王恒波、阙友雄、黄国强、郭晋隆、苏亚春， 1 NY/T2743—2015 甘蔗自色条纹病菌检验检疫技术规程实时荧光定量PCR法 1范围 本标准规定了甘蔗白色条纹病菌实时荧光定量PCR检测方法。 本标准适用于甘蔗种茎、种苗以及甘蔗或其他植物组织中的甘蔗白色条纹病菌（Xanthomonasal bilineans)的检验检疫与检测。本标准中PCR等缩略语参见附录A。甘蔗白色条纹病菌有关信息参见 附录B。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T28067甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 hrpB基因hrpBgene 植物病原细菌的一种过敏性反应和致病性基因（hypersensitive reaction and pathogenicitygene hrp）参与和介导过敏性反应（hypersensitiveresponse，HR）的发生，与植物病原细菌致病性密切相关。 hrpB基因是甘蔗白色条纹病菌的特异致病基因，编码细菌的类型Ⅱ蛋白分泌系统（typeⅢprotein se- 中，从而诱发宿主的各种效应。 4原理 利用荧光信号伴随着目标序列PCR扩增产物的增加而增强的原理，通过收集PCR扩增过程的荧 光信号值，即可判断试样是否带有目标序列。为此，在克隆甘蔗白色条纹病菌特异性致病基因hrpB全 长序列基础上，根据序列信息设计了PCR引物与探针，筛选获得特异性引物与探针，建立了一种基于 hrpB基因检测甘蔗白色条纹病菌的实时荧光定量PCR方法。 5试剂 PCR的用水要求达到一级水指标。 5.1氢氧化钠(10mol/L)溶液：在160mL水中加人80gNaOH,溶解后加水定容至200mL，塑料瓶中 保存。 5.2EDTA溶液(500mmol/L,pH8.0):称取二水乙二铵四乙酸二钠(NazEDTA·2HzO)18.6g,加 人70mL水中，加热至完全溶解后，冷却至室温，用10mo1/LNaOH溶液调pH至8.0，加水定容至100 mL。在121℃条件下灭菌20min。 5.3Tris-HCl溶液(1mol/L，pH8.0)：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800mL水中， 用浓盐酸调pH至8.0,加水定容至1000mL。在121℃条件下灭菌20min。 1 NY/T 2743—2015 5.4TE缓冲液(pH8.0)：分别加人Tris-HCl(pH8.0)10mL和EDTA(pH8.0)溶液2mL,加水定 容至1000mL。在121℃条件下灭菌20min。 5.5Tris-HCl(1mol/L，pH7.5)溶液：称取121.1gTris碱溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至 7.5，用水定容至1000mL。在121℃条件下灭菌20min 5.6氯仿：异戊醇溶液：将氯仿和异戊醇按照24：1的体积比混合。 5.7CTAB裂解液（1000mI）：在600mL水中加人81.7g氯化钠，20g十六烷基三甲基溴化铵 （CTAB），20g聚乙烯吡略烷酮（K30)（PVP），1gDIECA，充分溶解（需加热助溶），然后加人Tris-HCI pH7.5)100mL，EDTA（pH8.0)4mL，加水定容至1000mL，室温保存，使用时加人0.2%（V/V)的 β-巯基乙醇。 5.8其他试剂:适用于实时荧光PCR反应TaqDNA聚合酶(5U/μL)及其反应缓冲液、2.5mmol/L dNTPs、异丙醇、75%乙醇(V：V)。 6仪器设备 6.1实时荧光定量PCR扩增仪：激发/检测波长范围350nm～750nm；可用探针SYBRGreenI染料 和TaqMan探针；升降温速度≥2.0℃/s；均性十/一0.5℃；准确性十/一0.3℃；温度范围4℃~ 100℃。 6.2电泳仪：输出类型为恒压/恒流/恒功率输出；输出范围为10V~600V/1mA～500mA/1W～300 W；分辨率为电压1V、电流1mA、电功率1W；定时范围1min～5h以上。 6.3紫外分光光度计。 6.4低温冷冻离心机（4℃）。 6.5-80℃冰箱。 6. 6 微量加样器:0. 5 μL~10 μL、5 μL～20 μL、20 μL～~200 μL、200 μL～1 000 μL。 7样品的采集与前处理 7.1采样 7.1.1采样工具：按GB/T28067的要求执行。 7.1.2采样方法：按GB/T28067的要求执行。其中，叶片样品和蔗茎样品采集时首选可疑甘蔗病 株，蔗茎采回并去皮后，采用钳子直接挤压出汁5mL，蔗汁收集在5mL～10mL无菌离心管中，备 用。 7.1.3对照材料 阳性对照：用已知含甘蔗白色条纹病菌的样品或甘蔗白色条纹病菌纯培养物作为阳性对照。 阴性对照：用已知不含甘蔗白色条纹病菌的样品作阴性对照。 空白对照：用无菌一级水代替样品。 7.2样品存放与运送 按GB/T28067的要求执行。 8操作方法 8.1样品DNA提取 在样品处理区进行。 每个管进行编号。 2 NY/T 2743—2015 8.1.2称取0.2g样品材料，并用液氮研磨成粉末状（要保持液氮不挥发干净），置于1.5mL离心管 中，待液氮挥发完立即加人1mLCTAB裂解液，盖上管盖，震荡混匀并裂解30min～60min，于4℃下 12000g离心10min。 8.1.3移取7.1.2制备的蔗茎样品的汁液1mL于1.5mL离心管中，12000g离心10min，弃上清，留 沉淀，加入1mLCTAB裂解液，盖上管盖，震荡混匀并裂解30min～60min，于4℃下12000g离心 10 min. 8.1.4吸取8.1.2或8.1.3的上清液至另一个新的离心管中，加人1mL氯仿：异戊醇，盖住管盖，剧 烈振荡混匀约15s，室温静置3min后，于4℃下12000g离心15min。 8.1.5吸取0.5mL上清液至另一新的离心管中，加人0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min后， 于4℃、12000g离心15min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。 8.1.6小心倒出离心管中上清液，加人1mL75%乙醇洗涤，颠倒离心管2次～3次，7500g离心5min （离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。重复洗涤沉淀1次。 8.1.7小心倒出离心管中上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉 淀的一面，室温干燥10min～15min。 8.1.8加人50uL无菌TE缓冲液，溶解管壁上的DNA，轻轻混匀，2000g离心5s，冰上保存备用。 若短期保存（1年内），可放置一20℃冰箱；如需长期保存（超过1年），则应放置一80℃冰箱，或保存在 75%乙醇中置一20℃冰箱（避免反复冻融）。 8.1.9在紫外分光光度计上，测定DNA的光吸收值，估算DNA浓度，判断其质量是否符合后续PCR 检测对DNA的质量要求。当A260/A230值>2.0且A260/A280值=1.8～2.0时，提取的DNA质量 符合PCR的检测要求。 8.2实时荧光定量PCR检测 8.2.1引物/探针 引物/探针序列见表1，用无菌TE缓冲液（pH8.0）或无菌一级水分别将表1引物/探针稀释到 10 μmol/ L 表1实时荧光定量PCR引物/探针序列 检测基因检测引物/探针 引物/探针序列（5'—3'） PCR产物大小，bp hrpB F - 5'- CTGGTACTGCACCTGCTCTC- 3' 88 Hrp - q5 R - 5'- CTTCCGGGTAAGTGTTGGAC- 3' Probe FAM- 5'- ACGCCCACTGCAAGTCACCC- 3'- TAMRA 8.2.2PCR检测 8.2.2.1对照设置 PCR反应体系的模板；阴性对照是指用不含甘蔗白色条纹病菌的材料提取的DNA作为PCR反应体系 的模板；空白对照是指用无菌双蒸水代替DNA作为PCR反应体系的模板。上述各对照PCR反应体系 中，除模板外其余组分及PCR反应条件与8.2.2.2相同。 8.2.2.2PCR反应体系 按表1配制PCR扩增反应体系，也可采用等效的实时荧光PCR反应试剂盒配制反应体系（表2）， 每个试样和对照设3次重复。 3 NY/T 2743—2015 表2实时荧光定量PCR反应体系 试剂 终浓度 单样品体积 10×PCR缓冲液 1× 2.5 μL 25 mmol/ L MgCl." 2. 5 mmol/ L 2