ICS 67.080 B 31 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 27412015 仁果类水果中类黄酮的测定 液相色谱法 Determination of flavonoids in pome fruits- Liquid chromatography 2015-05-21 发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 2741—2015 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出。 本标准由全国果品标准化技术委员会（SAC/TC510)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院果树研究所、农业部果品及苗木质量监督检验测试中心（兴城）。 本标准主要起草人：李静、聂继云、李志霞、李海飞、徐国锋、闫震、匡立学、毋永龙。 I NY/T 2741—2015 仁果类水果中类黄酮的测定液相色谱法 1范围 本标准规定了液相色谱法测定仁果类水果中类黄酮的方法。 本标准适用于仁果类水果（苹果、梨和山楂)中主要类黄酮含量的测定。 本标准的方法检出限和定量限见附录A。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 仁果类水果中的类黄酮物质经乙醇溶液超声提取后，经固相萃取小柱净化，在反相C18色谱柱上 分离后，用紫外/二极管阵列检测器检测，外标法定量。 4试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1试剂 4.1.1盐酸(HCI)：优级纯。 4.1.2甲酸(CH2O2）:色谱纯。 4.1.3甲醇(CH4O)：色谱纯。 4. 1.4 乙醇(C2H.O)。 4.1.5乙睛(C²HN)：色谱纯。 4.1.680%乙醇溶液：取乙醇（4.1.4)800mL，加人200mL水，超声2min混匀。 4.2标准品 23种类黄酮标准品：纯度≥98%，名称见附录A。 4.3标准溶液配制 标准储备液，一18℃以下贮存，备用。 4.3.2混合标准溶液：混合标准溶液分为3组，其中组I和组Ⅲ用于苹果和山楂果实中类黄酮的定量， 组Ⅱ和组Ⅲ用于梨果实中类黄酮的定量。按照附录A中组别，根据各种黄酮类物质在仪器上的响应 值，逐一吸取一定体积的单组分标准溶液配制成混合标准溶液，再稀释成不同质量浓度的混合标准溶 液，用于制作标准工作曲线，混合标准溶液现用现配。 4.4材料 4.4.1有机相微孔滤膜：0.22μm。 4.4.2C18固相萃取小柱:200mg.6mL。 1 NY/T 2741—2015 5仪器 5.1液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器。 5.2电子天平：感量为0.01g和0.0001g。 5.3离心机：可达8000r/min以上。 5.4超低温冰箱：（一80士5）℃。 5.5超声波清洗器：40kHz。 5.6旋转蒸发仪：带有温度控制。 6试样的制备 果实洗净擦干，取可食部分切碎混匀，四分法取约250g，液氮冷冻，研成粉末，-80℃贮存备用。 7分析步骤 7.1提取 称取10g试样（精确到0.01g）于50.0mL棕色离心管中，加人约25mL80%乙醇溶液（4.1.6），混 合，室温下超声15min，8000r/min离心5min，上清液转人50.0mL棕色容量瓶中，残渣再用约15mL 80%乙醇溶液按上述步骤重复提取1次，合并2次提取液，用80%乙醇溶液定容至50.0mL，备用。 7.2浓缩 准确吸取10mL提取液（7.1）于100mL旋转蒸发瓶中，35℃下减压蒸发除去乙醇，浓缩至约3mL。 7.3净化 C18固相萃取小柱（4.4.2)依次用约5mL甲醇和约5mL水预淋洗、活化后，将7.2浓缩液加至小 柱中，旋转蒸发瓶用5ml水清洗，清洗液转入小柱中，抽滤，弃除滤液。再用约8mL甲醇分2次清洗 旋转蒸发瓶，清洗液加入到小柱中，收集滤液，甲醇定容至10.0mL，过滤膜（4.4.1），待测定。 7.4试剂空白试验 仅不加人样品，其他提取、浓缩和净化过程同样品相同。 7.5测定 7.5.1色谱参考条件 检测波长：280nm、360nm和520nm，各组分定量波长见附录A。 色谱柱：C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，颗粒度5μm，或性能类似的色谱柱。 柱温：40℃。 流速：0.8mL/min。 流动相A：20%甲酸；流动相B：100%乙。 进样量：10μL。 流动相梯度洗脱程序见表1。 表1流动相梯度洗脱程序 时间 流动相 流动相 min A B 0 100 0 30 75 25 45 60 40 60 40 60 61 100 0 80 100 0 2 NY/T 2741—2015 7.5.2 仪器测定 取标准工作溶液、样品待测液（7.3）及试剂空白（7.4)进样测定，以色谱峰保留时间定性，以标准工 作液多点校准定量。试剂空白不能检出有对被测组分有干扰的物质。 结果计算 样品中类黄酮物质以质量分数X计，按式(1)计算。 X=xV (1) m 式中： X-—-样品中待测组分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； 一标准曲线计算出试样提取液中各组分的浓度，单位为毫克每升（mg/L）； V-试样提取液定容体积，单位为毫升（mL）； 一试样质量，单位为克（g）。 计算结果保留小数点后两位。 色谱图 类黄酮标准溶液色谱图参见附录B。 10精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10%。 NY/T 2741-2015 附录A （规范性附录】 类黄酮标准物质基本信息、最佳定量波长、检出限和定量限 类黄酮标准物质基本信息、最佳定量波长、检出限和定量限见表A.1。 表A.1类黄酮标准物质基本信息、最佳定量波长、检出限和定量限 定量波长 检出限 定量限 序号 名 称 CAS号 分子式 组别 nm mg/ kg mg/ kg 1 原花青素B1 20315-25-7 Cso Hz. O12? 280 0. 15 0. 5 I 和Ⅱ 2 儿茶素 7295-85-4 Cis Hr O: 280 0. 15 0. 5 I 和I 3 原花青素B2 29106-49-8 Cao H2. O12 280 0. 15 0. 5 I和I 4 表儿茶素 490-46-0 Cis Hi O 280 0. 15 0. 5 I和Ⅱ 5 原花青素C1 37064-30-5 C4s Hs O18 280 0. 15 0. 5 I 和II 6 芦丁 153-18-4 C2, H3o O16 360 0. 075 0. 25 I 和II 榭皮素一半乳糖苷 482-36-0 Can Heo Or? 7 360 0. 075 0. 25 I 和 I [榭皮素—葡萄糖苷 8 21637-25-2 Ce, H2o O12 360 0. 075 0. 25 1和Ⅱ 9 皮素一木糖苷 549-32-6 C2o H: O11 360 0. 075 0. 25 10 皮素一阿拉伯糖苷 572-30-5 Cao His Ou 360 0. 075 0. 25 1 11 皮素一鼠李糖苷 522-12-3 Can Hao Ou 360 0. 075 0. 25 12 根皮苷 7061-54-3 C2. H2g O12 280 0. 06 0. 2 1 13 熊果苷 497-76~7 Ci2 H1s Of 280 3. 00 10. 00 14 木草一葡萄糖苷 5373-11-5 Ce, Hao O1 360 0. 075 0. 25 15 山萘酚芸香糖苷 17650-84-9 C2, Hao O1s 360 0.075 0. 25 16 异鼠李一芸香糖苷 604-80 -8 Czs H32 O16 360 0.075 0. 25 I 17 异鼠李一半乳糖苷 6743-92-6 Ca2 H2 O12 360 0.06 0. 20 11 18 异鼠李一葡萄糖苷 5041-82-7 Cz2 Hz2 O12 360 0. 075 0. 25 19 矢车菊素一半乳糖苷 27661-36-5 Cn Han CIOn 520 0.15 0.50 20 矢车菊素一葡萄糖苷 7084-24- 4 Cai H2i ClOn 520 0. 15 0. 50 21 矢车菊素一阿拉伯糖苷 57186 -11- 5 Cao His ClO1o 520 0. 15 1. 00 22 矢车菊素一木糖苷 29761 - 24 -8 Ca H1g ClO1o 520 0. 15 0. 50 II 23 氯化芍药一半乳糖苷 28148-89-2 C2 H2s CIO1 520 0. 15 0. 50 4 NY/T 2741—2015 附录B (资料性附录） 类黄酮标准溶液色谱图 B.1第I组类黄酮标准溶液色谱图 见图B.1。 280nm 20 1 12 nyu" 10 ] 10 吸 11 0 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 360nm 6 10 20] ,mAU 67 11 光度， 10 吸 01 25 30 35 40 45 50 55 60 70 时间，min 说明： 原花青素B1（20mg/L）； /- 榭皮素一半乳糖苷（10mg/L）； 儿茶素（20mg/L）； 一榭皮素一葡萄糖苷(10mg/L)； 原花青素B2（20mg/L）； -皮素一木糖苷(10mg/L) 4- 表儿茶素（20mg/L）； 10- 榭皮素-阿拉伯糖