ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2729—2015 李属坏死环斑病毒检测规程 Criterion for prunus necrotic ringspot virus detection 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 2729—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：农业部花卉产品质量监督检验测试中心（昆明）、云南省农业科学院花卉研究所、 国家观赏园艺工程技术研究中心、云南省花卉育种重点实验室、云南省花卉工程技术研究中心 本标准起草人：王丽花、瞿素萍、王继华、杨秀梅、吴学尉、王其刚、张艺萍、张丽芳、苏艳、彭绿春， 一 NY/T 2729—2015 李属坏死环斑病毒检测规程 1范围 吸附检测法(DAS-ELISA)和指示植物检测法。 本标准适用于植物组织中李属坏死环斑病毒的检测。 2取样 根据样品属性，取发芽幼苗、腋芽、枝条韧皮部、果实表皮、叶片、鳞片外表皮等器官或组织，洁净水 洗净后备用。 3检测方法 3.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA) 3.1.1原理 利用抗原(病毒)与其特异性抗体在离体条件下产生专一性反应的原理。即存在于样品中的病毒颗 粒首先被吸附在酶联板孔中的单克隆抗体捕捉后，再与碱性磷酸酯酶标二抗结合反应，后加入碱性磷酸 酶底物，酶将底物水解并产生有色产物。颜色的深浅与样品中病毒的含量成正比，若样品不携带病毒则 无颜色反应。 3.1.2仪器、用具及耗材 酶标仪（配405nm滤光片），恒温培养箱（温度可调范围0℃40℃），生物培养箱（具光照、温度可 调范围0℃～50℃），电子天平（感量为0.01g、0.0001g），酸度计。微量移液器（200μL～1000μL， 10μL～100μL，0.5μL～10μL），酶联板，研钵或自封袋，微量移液器吸头，离心管等。 3.1.3试剂 3.1.3.1所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。 3.1.3.2抗体和对照 PNRSV抗体、阳性对照、阴性对照或DAS-ELISA检测试剂盒均来自市售。 3.1.3.3包被缓冲液（pH9.6,贮藏于4℃) 碳酸钠（Na2CO：） 1.59 g 碳酸氢钠（NaHCOs） 2.93 g 叠氮化钠（NaN） 0.2 g 加蒸馏水溶解定容至1000mL。 3.1.3.4洗涤缓冲液(PBST,pH7.4) 氯化钠(NaCI) 8.0 g 无水磷酸二氢钾（KH2PO） 0.2 g 无水磷酸氢二钠（Na2HPO4） 1.15 g 氯化钾（KCI) 0.2 g 吐温-20(Tween-20) 0.5 g 加蒸馏水溶解定容至1000mL。 3.1.3.5样品提取缓冲液（GEB,pH7.4，贮藏于4℃） 1 NY/T 2729--2015 脱脂奶粉 2. 0 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW24 000~40000） 20.0 g 无水亚硫酸钠（Na2SOs） 1.3g 叠氮化钠（NaN3） 0.2 g 吐温-20（Tween-20） 20.0 g 溶于PBST中，定容至1000mL。 3.1.3.6酶标抗体稀释缓冲液(EC1,pH7.4,贮藏于4℃) 牛血清白蛋白(BSA) 2.0g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW24 000~40000） 20.0 g 叠氮化钠（NaNa） 0.2 g 溶于PBST中，定容至1000mL。 3.1.3.7底物缓冲液(PNP,pH9.8,贮藏于4℃) 二乙醇胺 97.0mL 六水氯化镁（MgCl2·6H2O) 0.1 g NaN: 0.2 g 3.1.3.8底物溶液（现用现配） 根据需要称取对硝基苯磷酸二钠(PNPP)溶于底物缓冲液中配制成1mg/ml的底物溶液。 3.1.3.9终止液(3mol/L氢氧化钠溶液） 称取120gNaOH,溶于1000mL蒸馏水中。 3.1.4操作步骤 3.1.4.1包被抗体 在酶标板孔中加入100uL用包被缓冲液按工作浓度稀释好的抗体，将酶标板用保鲜膜包好放人湿 盒中，置于4℃冰箱内孵育过夜或室温（20℃～25℃）下孵育4h。 3.1.4.2试样制备 将待测试样和GEB按1：10（g/mL）的比例放人研钵或≥0.2mm的加厚自封小塑料袋中磨碎至 匀浆，后转人离心管800r/min～1000r/min离心2min，获得上清液。阳性对照、阴性对照的上清液制 备同上，阳性样品为已知的携带PNRSV的材料或试剂盒提供的阳性对照；阴性样品为已知的不携带 PNRSV的材料或试剂盒提供的阴性对照。 3.1.4.3洗板 孵育结束后，将孔内液快速倒出，每孔加满PBST清洗酶标板，清洗4次～6次，每次停留1min~ 2min。清洗完成后在洁净吸水纸上拍出孔内残液。 3.1.4.4包被试样 吸取3.1.4.2的上清液加人清洗完成后的酶标板，每孔加100μL，每个待测样品设置重复，同时设 阳性对照、空白对照和阴性对照。将酶标板用保鲜膜包好放人湿盒中，4℃冰箱内孵育过夜或21℃～ 24℃下孵育2.0h～2.5h。 3.1.4.5洗板 同3.1.4.3。 3.1.4.6包被酶标抗体 包被前按酶标抗体稀释比例在干净玻璃管或聚乙烯管中加人一定体积的EC1和酶标抗体充分混 匀，酶标板每孔加100uL，完成后将酶标板用保鲜膜包好放人湿盒，21℃～24℃下孵育2.0h～2.5h。 3.1.4.7洗板 2 NY/T 2729—2015 同3.1.4.3。 3.1.4.8加底物溶液 每孔加人100μL配制好的底物溶液。酶标板用保鲜膜包好放人湿盒中21℃～24℃下蔽光显色30 min～60min。显色达到要求后，每孔加入50μL终止液终止反应。 3.1.4.9酶标仪读数 终止反应20min内，将酶标板置于酶标仪中，在405nm波长下测量吸光度值（OD405），并记录结 果。 3.1.5结果判断 3.1.5.1检测结果有效性判断 当肉眼看阳性对照显色、空白对照和阴性对照无色，重复测定值的精密度β<20%时，判为有效检 测结果；否则视之为无效检测结果，需重新检测。 β=|OD405-1—OD405-21/（OD405-1十OD405-2）×2×100（OD405-1和OD405-2为同—试样重复的吸光 度值)。 3.1.5.2检测结果判断 试样平均OD405值/阴性对照平均OD405值≥2时，判为阳性。 试样平均OD405值/阴性对照平均OD405值≤1.5时，判为阴性。 试样平均OD405值/阴性对照平均OD405值在1.5～2之间，判为可疑试样，需重新检测一次，或用其 他方法进一步确认。 3.1.5.3若为商品试剂盒，根据试剂盒说明进行判断。 3.2指示植物法 3.2.1原理 种类的方法。即用感病的植物叶片与少许金刚砂混合，研磨成粗汁液，然后蘸取汁液摩擦供试植物叶 片，经蒸馏水清洗后，置于隔离温室内观察症状表现。 3.2.2接种缓冲液 称取0.252gNa2SO3溶于预先配制好的0.01mol/LPBS缓冲液（称取0.8g氯化钠，0.02g氯化 钾，0.115g七水磷酸氢二钠，0.019g无水磷酸二氢钾溶于蒸馏水中，定容至100mL），定容至100mL。 3.2.3栽植指示植物 机质土壤的花盆中，盆间距50cm×50cm，待有4真叶～6真叶后准备接种。栽植环境条件为温度为 20℃～25℃，光照时数为12h。 3.2.4摩擦接种 将待测样品按1：3（g/mL）的比例与接种缓冲液混合研磨，用细纱布过滤匀浆液，在1000g～ 10000g下离心10min～15min后取上清液。接种时，在3.2.3准备的指示植物叶面撒少量600目金 刚砂，用研磨棒蘸取上清液轻轻摩擦接种叶片。接种后，用蒸馏水冲洗被接种叶片上的残留汁液。每株 指示植物接种2个～3个叶片且只接种一个样品，并设阳性对照（带毒植株）、阴性对照（健康植株）和空 白对照(接种缓冲液）。 3.2.5记录 接种后20d内，每日观察、记录指示植物症状。 3.2.6结果判断 接种5d～18d后发病，根据表1指示植物症状，确定病毒携带情况。在所有接种的指示植物中只 要有一株表现典型症状，该样品即为阳性。 NY/T 2729—2015 表1 鉴别寄主症状 指示植物 症状 中文名 拉丁学名 接种后4d～5d子叶产生扩散性褪绿斑，第6d～第18d 黄瓜 Cucunis sativus 出现顶枯现象 接种后5d～18d幼苗叶片上产生环斑或弧形斑，后生长 毛樱桃 Prunus tomentosa 菱陷和死亡 山樱花 Prumus serrulata 接种后5d～10d芽局部性坏死、流胶 接种后5d～6d产生局部或系统褪绿环斑，或灰色坏死 昆诺藜 Cheno podium quinoa 斑，心叶畸形 4判定 检测结果为阳性即可判断为待测试样携带李属坏死环斑病毒。 NY/T 2729—2015 表1 鉴别寄主症状 指示植物 症状 中文名 拉丁学名 接种后4d～5d子叶产生扩散性褪绿斑，第6d～第18d 黄瓜 Cucunis sativus 出现顶枯现象 接种后5d～18d幼苗叶片上产生环斑或弧形斑，后生长 毛樱桃 Prunus tomentosa 菱陷和死亡 山樱花 Prumus serrulata 接种后5d～10d芽局部性坏死、流胶 接种后5d～6d产生局部或系统褪绿环斑，或灰色坏死 昆诺藜 Cheno podium quinoa 斑，心叶畸形 4判定 检测结果为阳性即可判断为待测试样携带李属坏死环斑病毒。