ICS 65.020.30 B 43 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2695—2015 牛遗传缺陷基因检测技术规程 Code of practice for molecular detecting for genetic defects in cattle 2015-02-09 发布 2015-05-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 2695—2015 前 本标准按照GB/T1.1-—2009给出的规则起草， 本标准由农业部畜牧业司提出 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。 本标准起草单位：全国畜牧总站，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：刘丑生、刘刚、朱化彬、韩旭、王皓、冯海永、赵俊金、孟飞、邱小田。 I NY/T 2695--2015 牛遗传缺陷基因检测技术规程 1范围 本标准规定了牛遗传缺陷基因的检测方法和结果判定。 本标准适用于奶牛和肉牛白细胞黏附缺陷症、瓜氨酸血症、牛尿苷酸合酶缺乏症、牛脊椎畸形综合 征、牛凝血因子X缺乏症、牛并趾征、牛蜘蛛腿综合征基因的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T25887奶牛脊椎畸形综合征检测PCR-RFLP法 GB/T27642—2011牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法 GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范 NY/T1670-2008猪雌激素受体和卵泡刺激素β亚基单倍体型检测技术规程 SN/T1119进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法PCR方法 SN/T2497.15进出口危险化学品安全试验方法第15部分：PCR-SSCP实验 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 遗传缺陷genetic defects 家畜生殖细胞或受精卵中的遗传物质在结构或功能上发生了改变，从而使发育个体表现缺陷，具有 垂直遗传和终生性特征。 3. 2 单基因遗传缺陷monogenic genetic defects 单个基因变异而引起的遗传缺陷，其遗传方式符合孟德尔遗传定律。 3. 3 牛白细胞黏附缺陷症bovineleukocyteadhesiondeficiency，BLAD 由嗜中性粒细胞表面糖蛋白细胞黏附分子整合素的β2亚单位基因CD18(β-2 integrin subunit， alsocalled CD18)第2外显子第55位碱基发生(A→G)突变引起的一种牛隐性遗传缺陷。其典型临床 症状为重复性感染，鼻镜肿胀，颌下淋巴结肿大，常发生口腔、舌和肠道黏膜溃疡，并导致早期死亡。 3. 4 瓜氨酸血症citrullinemia,CN 由精氨酸琥珀酸合酶基因ASS(argininosuccinate synthase)的第5外显子第256位碱基发生（C→ T)突变引起的一种牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状为犊牛第1d～第2d出现精神沉郁、步态紊乱、 惊厥、失明等。 3.5 牛脊椎畸形综合征complexvertebralmalformation，CVM 由编码UDP-N-乙酰葡糖胺载体的基因SLC35A3（solutecarrierfamily35memberA3）的第4外 I NY/T 2695—2015 显子第73位碱基突变(G→T)引起的一种牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状表现为胚胎或胎儿死亡， 或犊牛脊椎弯曲畸形、肋骨畸形、心脏畸形、颈短、两前腿筋腱缩短等。 3. 6 牛尿苷酸合酶缺乏症deficiencyof uridinemonophophate synthase，DUMPS 由尿苷酸合酶基因UMPS（uridinemonophophate synthase)的C-末端405处的密码子存在一个点 突变导致密码子CGA转变为终止子TGA引起的一种牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状为胚胎或胎 儿期死亡，死亡率达100%。 3. 7 牛凝血因子X缺乏症factorXdeficiency，FX 由凝血因子虹基因FX（factorX)外显子12上插入厂一个大小为76bp的DNA片段引起的一种 牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状为FXI携带者一般不表现症状，部分携带者和纯合个体表现为凝血 紊乱、造成犊牛成活率降低和繁殖性能下降以及免疫力降低。 3.8 牛并趾征syndactyly 牛骤蹄症mulefoot，MF 由低密度脂蛋白受体结合蛋白基因LPR4（lowdensitylipoproteinreceptorrelatedprotein4）第33 外显子发生了两个碱基的突变（C4863A，G4864T)引起一种牛遗传缺陷。其典型临床症状为在不同品 稳，生产性能下降。 3. 9 牛蜘蛛腿综合征spiderleg of arachnomelia and arthrogryposis, syndrome of arachnomelia and ar- throgryposis, SAA; arachnomelia syndrome, AS 在瑞士褐牛中由SOUX（sulfiteoxidase）基因第4外显子第363位插人一个碱基（c.363-364insG） 而引起，在西门塔尔牛中由MOCS1（molybdenumcofactorsynthesis step1）基因位于第11外显子第 1224～1225位CA两个碱基的缺失而引起的一种牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状为在瑞士褐牛和 西门塔尔牛中出现，AS个体表现为牛先天性骨骼畸形、体重较轻，造成死胎或出生后不久死亡。 3.10 系谱 pedigree 在调查某种遗传病畜禽各个个体的发病情况后，采用特定的符号和格式绘制成反映该群体各个个 体相互关系和发病情况的图解。 4原理 4.1牛白细胞黏附缺陷症的检测 利用CD18基因的DNA序列特异性引物，扩增CD18基因片段.采用PCR-SSCP或PCR-RFLP 方法确定个体基因型。 4.2瓜氨酸血症的检测 利用ASS基因的DNA序列特异性引1物，扩增ASS基因片段，采用PCR-SSCP或PCR-RFLP方 法确定个体基因型。 4.3牛脊椎畸形综合征的检测 PCR突变分析确定个体基因型。 4.4牛尿苷酸合酶缺乏症的检测 2 NY/T2695—2015 利用尿苷酸合酶基因的DNA特异性引物，扩增尿苷酸合酶基因片段，采用PCR-RFLP方法确定 个体基因型。 4.5牛凝血因子X缺乏症的检测 利用凝血因子XI缺乏症FXI基因特异性引物扩增，采用PCR检测确定个体基因型。 4.6牛并趾征的检测 利用LPR4基因DNA序列设计引物进行扩增，采用测序方法确定个体基因型。 4.7牛蜘蛛腿综合征的检测 利用SOUX基因或MOCS1基因DNA序列设计引物进行扩增，采用测序的方法确定个体基因型。 5仪器设备及试剂 5.1仪器设备 5.1.1离心机，离心力10000g。 5.1.2紫外可见分光光度计。 5.1.3移液器，量程0.1μL～1000μL。 5.1.4PCR仪，96孔热循环。 5.1.5水平电泳槽，长度31cm。 5.1.6凝胶成像系统。 5.2试剂 5.2.1 AvaI内切酶。 5.2.2AuaⅡ内切酶。 5.2.3Eco47I内切酶。 5.2.4TaqI内切酶。 5.2.5 Taq DNA 聚合酶。 5.2.6乙醇(ethanol)，分析纯。 5.2.7桌 异丙醇（isopropanol），分析纯。 5.2.82 乙二胺四乙酸二钠（EDTA），分析纯。 5.2.9盒 氯化钠（NaCI），分析纯。 5.2.10十二烷基硫酸钠(SDS),分析纯。 5.2.11乙酸，分析纯。 5.2.12溴化乙锭，分析纯。 5.2.13三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris Base),分析纯。 5.2.14琼脂糖（分析纯）。 5.2. 15Tris-HCI(pH 6.8):将12.1g Tris Base 溶于 80mL蒸馏水中,用浓 HC1 将 pH调至 6.8,将 体积调至100mL，高压除菌，室温储存。 5.2.16缓冲液： a) DNA溶解缓冲液(TE):取5mL 1mol/L Tris-HCIBuffer(pH=8.0)和 0.5mol/LEDTA （pH=8.0)加人400mL蒸馏水的烧杯中，将溶液定容到500mL后，高温高压灭菌，室温保存； b) 电泳解缓冲液50×TAE：称取242gTrisBase、37.2gNazEDTA加人1L烧杯中，然后加人 800mL去离子水，充分搅拌溶解，再加人57.1mL醋酸，充分混匀定容至1L，室温保存； c）10×上样缓冲液：用移液器吸取2mLEDTA（500mmol/L，pH8.0）加人约40mL蒸馏水中， NY/T 2695—2015 再称取250mg溴酚蓝，量取50mL丙三醇，定容至100mL，4℃保存。 漠化乙锭或其他燃料。 溴化乙锭或其他燃料。 6检测步骤 6.1样品制备 收集牛血液、组织（耳组织、肌肉、尾组织、皮肤等）、带毛囊的毛发或精液等材料。其中，血液用抗凝 剂处理，并4℃短期保存，一20℃及以下低温保存备用；组织、带毛囊的毛发浸入75%的酒精、精液， 一20℃及以下低温保存备用。 6.2DNA的提取 按GB/T27642一2011中附录B规定的方法执行。DNA样品操作注意事项按SN/T1119中规定 的方法执行。 6.3引物配制 引物配制按NY/T1670一2008中6.2.1条款的规定执行，引物信息参见附录A中A.1。 6.4PCR反应 6.4.1PCR反应体系和程序 按附