ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2679---2015 甘蔗病原菌检测规程 宿根矮化病菌 环介导等温扩增检测法 Detection procedures of sugarcane pathogen--Leifsonia xyli subsp.xyli- Detection method of loop-mediated isothermal amplification 2015-02-09发布 2015-05-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 2679—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部种植业管理司提出。 本标准由全国果品标准化技术委员会（SAC/TC510)归口。 本标准起草单位：福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室、农业部甘蔗及制品 质量监督检验测试中心。 本标准主要起草人：许莉萍、阙友雄、郭晋隆、吴期滨、陈如凯、周定港、罗俊、陶玲。 1 NY/T 2679—2015 甘蔗病原菌检测规程宿根矮化病菌环介导等温扩增检测法 1范围 本标准规定了环介导等温扩增技术检测甘蔗宿根矮化病菌(Leifsoniaryli subsp.ryli)的原理、试 剂和材料、仪器和设备、操作步骤、结果判定与表述等技术内容。 本标准适用于甘蔗组培苗、田间植株、种苗、种茎中甘蔗宿根矮化病菌的LAMP检测。 2缩略语和符号 2.1下列缩略语适用于本标准 2.1.1 LAMP：loop-mediated isothermal amplification,环介导等温扩增。 2.1.2dNTPs Mixture.deoxyribonucleoside triphosphates mixture，脱氧核苷三磷酸混合液。 2. 1. 3 ddH,O: double distiled HzO,双蒸水。 2. 1. 4 CTAB;hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵。 2.1.5 Tris:tris(hydroxymethyl)methyl:aminomethane，三(羟甲基)氨基甲烷。 2. 1. 6 EDTA,Edetate disodium,乙二胺四乙酸钠。 2. 1.7 LF:forward loop primer，正向环引物。 2. 1. 8 LB:backward loop. primer,反向环引物。 2.2下列符号适用于本标准 2.2.1F3c：在靶基因的3末端设定的个区段。 2.2.2F2c：在靶基因的3末端设定的一个区段，位于F3c的5'端。 2.2.3F1c：在靶基因的3末端设定的一个区段，位于F2c的.5端。 2.2.4B1：在靶基因的5°末端设定的一个区段。 2.2.5B2：在靶基因的5'末端设定的二个区段，位于B1的5'端。 2.2.6B3：在靶基因的5'末端设定的一个区段，位于B2的5'端。 2.2.7F3（forwardouter.primer）：正向外引物，含有与日标DNA上的F3c序列互补的区段。 2.2.8B3（backwardouterprimer）：反向外引物，含有与目标DNA上的B3相同序列的区段。 2.2.9FIP(forward inner primer)：正向内引物，在3'末端含有与F2c互补的F2区段，在5'末端含有 与F1c相同序列的区段。 2.2.10BIP(backward inner primer);反向内引物,在.3'末端含有与B2c互补的B2区段，在5'末端含 有与 Blc相同序列的区段。 3原理 LAMP是一种恒温核酸扩增方法。DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链 DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离成为单链。在靶基因的3'末端设定F3c、 F2c、F1c3个区段，在5末端设定B1、B2、B33个区段。针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用 链置换DNA聚合酶在等温（65C左右）条件下保温一定的时间，即可完成核酸扩增反应。以感染了甘 蔗宿根矮化病菌（Leifsoniarylisubsp.ryli，Lxx)的甘蔗为供试样品，提取的甘蔗总DNA里含有病原 细菌的DNA，可用于检测。 NY/T 2679—2015 4试剂 除另有规定外，所用试剂均为分析纯， 4.1 2XCTAB抽提缓冲液:含100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),20 mmol/LEDTA,1.4 mol/LNaCl, 2.0%CTAB，配方见附录A。该缓冲液在121℃下热灭活20min～30min，使用前加人0.1%(V/V)的 β-巯基乙醇。 4.2氯仿/异戊醇(V/V)24：1。 4.3检测引物序列。 4.3. 1F3:5'-ACATCGGTACGACTGGGT-3°。 4.3.2 B3:5'- TGGCCGACCAAAAAAGGT-3'。 4. 3. 3FIP(F1c+F2) : 5'-GGCGTACTAAGTTCGAGCCGTT-GGTCAGCTCATGGGTGGA - 3' 。 4. 3. 4BIP(B1c+B2) : 5'-CCTCGCACATGCACGCTGTT-CTCAGCGTCTTGAAGACACA - 3'。 4. 3.5 LF:5'- CTCCGCACCAATGTCAATGT - 3'。 4.3.6LB:5'- CTGAGGGACCGGACCTCATC- 3。 4.4其他试剂：dNTPMixture(各10mmol/L）；含有10XReactionBuffer(反应缓冲液）的BstDNA聚 合酶；乙二胺四乙酸二钠（NazEDTA·2H2O）；6mol/L盐酸（HCI)；2mol/L氢氧化钠（NaOH）；嵌人 型染料SYBRGreenI（1000×）；乙醇；异丙醇；β-巯基乙醇；75%乙醇；液氮；过氧化氢（H2O2）。 5仪器和设备 5.1高速台式冷冻离心机：相对离心力12000g以上，温度4℃～8℃。 5.2常温离心机：相对离心力3000g以上。 5.3小型离心机：可用于PCR反应管瞬间低速离心用的小型离心机。 5. 4 微量加样器: 0. 1 μL~ 2. 5 μL,1 μL~ 10 μL,2 μL～ 20 μL,10 μL~100 μL, 20 μL～ 200 μL, 100 μL~1 000 μL。 5.5恒温水浴锅：要求具有显示温度的功能。 5.6其他设备：冰箱（2℃～4℃和一20℃)；高压灭菌锅；鼓风干燥箱；液氮罐；核酸蛋白分析仪或紫外分 光光度计；电子天平（感量0.001g）。 5.7取样工具：砍刀、剪刀、镊子、带槽钻子、钳子。 5.8耗材：离心管、PCR反应管、Tip头、滴管、100mL和1000mL容量瓶、100mL和1000mL细口 瓶。 6检测方法 6.1样品的采集与前处理 6.1.1取样 取样工具进行消毒处理，砍刀采用3%的H2O2溶液浸泡30min以上，其他工具采用（121土2）℃ （1.1×105Pa）高压灭菌15min或160℃干烤2h。取样过程中应避免样品交叉污染，每取1个样品后， 取样工具用75%乙醇进行擦拭消毒。取样和样品前处理过程中应戴一次性手套，每个样品采集2份平 行样。样品采集后，置于一次性保鲜袋中，编号备用。 6.1.1.1蔗茎：采集中部蔗茎1节～2节，平行样的样品应采自同一蔗兜的不同植株。蔗茎去皮后，采 用钳子直接挤压出汁，蔗汁收集在5mL～10mL无菌离心管中。也可采用带槽钻子直接在田间甘蔗蔗 茎中部取汁。 2 NY/T 2679—2015 6.1.1.2组培苗：小苗样品采集全株，株高超过25cm的也可采集叶片，2叶为1份。 6.1.1.3叶片：采集甘蔗植株中部带有中脉的叶片，1片为1份，平行样的样品应采自同一蔗兜的不同 植株。 6.1.2对照材料 6.1.2.1阳性对照：用已知含甘蔗宿根矮化病原菌的样品做阳性对照。 6.1.2.3空白对照：用等体积的无菌ddH20替代样品做空白对照。 6.1.3样品存放与运送 样品采集后，应放置在4℃左右的冰箱中，建议在1d进行后续操作，但可以延长到4d。若需长途 运送，可采用保温箱中加冰块密封后运送。 6.2总DNA提取 6.2.1取数支2.0mL无菌离心管，并进行编号。 6.2.2称取0.2g甘蔗组培苗和叶片样品，加入液氮研磨成粉末状（研磨过程要保持液氮不挥发干 净），用小药勺将组织粉末转移到2.0mL无菌离心管中，待液氮挥发完，备用；取2.0mL蔗汁样品于 心10min，弃上清液，留下沉淀，备用。 6.2.3向装有样品的离心管中加人800uL预热（约65℃）的2×CTAB抽提缓冲液，充分摇匀。65℃ 保温40min，保温期间，每隔5min颠倒3次～4次混匀。 6.2.44℃下12000g离心10min，弃沉淀，取上清液移至新的无菌离心管中，加人等体积氯仿/异戊醇 （V/V=24：1），剧烈振荡30s。 6.2.5吸取上层清液至另一新的无菌离心管中，加入2/3体积预冷（一20℃）的异丙醇或2倍体积的 100%乙醇，轻轻颠倒混匀，于一20℃下放置30min或4℃～8℃下静置过夜，待DNA析出。 4500g离心5min，弃去上清液，晾干或用灭菌过的滤纸吸干后，加灭菌双蒸水50μL溶解（大约0.5h）， 得到样品DNA溶液。 定波长260nm和280nm处的吸光值A260和A280，A260/A280比值在1.7～2.1才能用于后续试验。如该 比值不在此区间，说明质量不符合要求，应重新制备样品DNA溶液。DNA浓度按式（1)计算。 c