ICS 65.020.01 B 15 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2678—2015 马铃薯6种病毒的检测 RT-PCR法 Detection of the six potato viruses--RT-PCR method 2015-02-09发布 2015-05-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 2678—2015 前言 本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨）、湖南农业大学园艺学 院、华中农业大学生命科学技术学院、福建农林大学。 本标准主要起草人：张威、白艳菊、李学湛、柳俊、詹家绥、聂碧华、胡新喜、何长征、高艳玲、范国权、 申宇、张抒、王晓丹、王文重、魏琪、邱彩玲、耿宏伟、董学志、万书明。 NY/T2678—2015 马铃薯 6种病毒的检测RT-PCR 法 1范围 本标准规定了马铃薯S病毒（PotatovirusS，PVS）、马铃薯X病毒（PotatovirusX，PVX）、马铃薯 M病毒（PotatovirusM,PVM)、马铃薯Y病毒（PotatovirusY,PVY）、马铃薯卷叶病毒（Potatoleaf roll virus，PLRV)和马铃薯A病毒（PotatovirusA，PVA)的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)分子 生物学检测方法（见附录A）。 本标准适用于马铃薯试管苗、原原种和田间马铃薯块茎、植株等组织中病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 本标准采用反转录一聚合酶链式反应（reverse-transcriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR） 方法检测马铃薯病毒。其原理是，将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR)相结合的 技术，RNA在反转录酶的作用下反转录成cDNA，再以cDNA为模板，在TaqDNA聚合酶的作用下进 行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断该样品中是否含有目的片段，从而达到鉴定病毒的目的。 4试剂和材料 以下所有试剂，除非另有规定仅使用分析纯试剂，水为符合GB/T6682中规定的一级水。 4.1TRIzoIRNA提取试剂 4.2三氯甲烷 4.3异丙醇 4.475%乙醇 量取无水乙醇75mL，加水定容至100mL。 4.5M-MLV反转录酶(200U/L) 4.6RNA酶抑制剂(40U/L) 4.7TaqDNA聚合酶(5U/L) 4. 8 10 × PCR buffer( Mg+ free) 4. 9MgCl2 (25 mmol/L) 4.10dNTP混合物（各2.5mmol/L) 4.11焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水 在100mL水中，加人焦碳酸二乙酯（DEPC）50μL，室温过夜，121℃高温灭菌20min，分装到 1.5mLDEPC处理过的离心管中。 4.1210×TAE电泳缓冲液 羟基甲基氨基甲烷(Tris)242g，冰乙酸57.1mL，乙二胺四乙酸二钠·2H2O37.2g，用氢氧化钠调 pH至8.5,加水定容至1000mL。 1 NY/T2678—2015 4.131×TAE电泳缓冲液 量取10×TAE电泳缓冲液（4.12)100mL，加水定容至1000mL。 4.14溴化乙锭溶液（10mg/L） 称取溴化乙锭200mg，加水溶解，定容至20mL。 4.151.5%琼脂糖凝胶板 称取琼脂糖1.5g，加人1×TAE电泳缓冲液（4.13)定容至100mL，微波炉中加热至琼脂糖融化， 梳子，备用。 4.16引物缓冲液 用DEPC水将上、下游引物分别配制成浓度为100ng/uL的水溶液。 4.17100bpDNA分子量标准物 4.18阳性对照 参见附录B中B.1。 4.19阴性对照 参见附录B中B.2。 5主要仪器 5. 1 PCR 仪。 5.2台式低温高速离心机。 5.3电泳仪、水平电泳槽。 5.4凝胶成像仪。 5.5微量移液器(0.5L10L、10L~100L、20L~200L、100L～1000L)。 5.6灭菌锅等。 6# 操作步骤 6.1对照的设立 照），在检测过程中要同待测样品一同进行如下操作。 6.2样品制备 取马铃薯试管苗、块茎芽眼及周围组织或茎叶组织0.05g～0.1g，现用现取或4℃条件下保存，最 多存放3d。 6.3RNA提取 将样品置于研钵中，加液氮研磨成粉末，转至1.5mL离心管，加入1mLTRIzol混匀，使其充分裂 解；4℃14000g离心5min；取上清，加人200μL三氯甲烷，振荡混匀，室温放置15min；4℃12000g离 心15min；吸取上层水相至新1.5mL离心管中，加人0.5mL异丙醇，混匀，室温放置10min；4℃ 12000g离心10min；弃上清，留沉淀，加人1mL75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃7500g离 心5min，弃上清，将离心管倒置于滤纸上，自然干燥；加人25uL～100uLDEPC水溶解沉淀，即得到 RNA. 6.4单重RT-PCR 6.4.1反转录 6.4.1.1反转录引物 2 NY/T 2678—2015 PVS(用附录C中PVS的第1对引物）、PVX、PVM、PVY、PLRV或PVA病毒的特异性下游引物 ［也可以用随机引物或oligo-dT(但不适用于PLRV，只能用于其他5种病毒)]。 6.4.1.2RNA预变性 取2.5μLRNA,65℃8min,RNA冰上放置2min; 6.4.1.3反转录反应体系 加人0.5uL下游引物，反转录反应程序和反应体系中其他成分按照反转录酶说明书，混合物瞬时 离心，使试剂沉降到PCR管底。反转录反应后取出直接进行PCR或置一20℃保存。 6.4.2PCR扩增 6.4.2.1PCR扩增引物 特异性引物（见附录C）。 6.4.2.2PCR反应体系 按表1顺序加入试剂，混匀，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。 表 1PCR扩增反应体系 用量 试剂名称 μL DEPC水 16. 5 反转录产物 2. 0 上游引物 0.5 下游引物 0. 5 10×PCR缓冲液 2. 5 MgCl2 2. 6 dNTP 0. 25 Taq酶 0. 15 总量 25 6.4.2.3PCR反应程序 92℃预变性5min；92℃变性30s，55.5℃退火30s，72℃延伸45s，循环30次；72℃延伸8min。 6.5 多重 RT-PCR 采用双重和三重RT-PCR检测PVS、PVX、PVM、PVY、PLRV和PVA病毒。应用固定的组合， 双重RT-PCR病毒组合：PVY+PLRV、PVM+PVS、PVX+PVA；三重RT-PCR病毒组合：PVY+ PVS+PLRV,PVX+PVM+PVA。 6.5.1反转录 执行双重RT-PCR的反转录时，每种病毒下游引物加0.5μL,DEPC水减少0.5μL；执行三重 RT-PCR的反转录时，每种病毒下游引物加0.5uL,DEPC水减少1.0uL，其他操作参照6.4.1。 6.5.2PCR扩增 执行双重PCR时，每种病毒上、下游引物各加0.5uL，DEPC水加人15.5μL；执行三重PCR时，每 种病毒上、下游引物各加0.5uL，DEPC水加入14.5uL，其他操作参照6.4.2。 6.6PCR产物的电泳检测 在电泳槽中加入1XTAE电泳缓冲液，使液面刚刚超过琼脂糖凝胶板。取5μLPCR产物分别和 2uL加样缓冲液混合后，加人到琼脂糖凝胶板的加样孔中，以5uL100bpDNA分子量标准物为参照物 在恒压（120V~150V）下电泳20min～30min，将凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。 7结果 7.1试验成立的条件 3 NY/T 2678—2015 阳性对照的扩增产物检测到预期大小的特异性条带，阴性对照和空白对照的扩增产物均没有检测 到预期大小的目的条带。阴性、阳性和空白对照同时成立则表明试验有效，否则试验无效。检测结果判 定图参见附录D。 7.2阳性判定 待检样品如果在729bp、711bp、520bp、447bp、336bp或273bp对应位置出现特异性条带，则判 定样品为PVS、PVX、PVM、PVY、PLRV或PVA病毒阳性；如果在729bp对应位置没有出现特异性条 带，再用引物PVS-F1，PVS-R1对样品进一步扩增，如果在602bp对应位置出现特异性条带则判断样 品为PVS病毒阳性。 7.3阴性判定 如果相应病毒电泳谱带没有扩增到预期大小的特异性条带，则判定样品为该病毒阴性。 4 NY/T 2678—2015 附录A （规范性附录） 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 A.1PVS:马铃薯S病毒(Potato virus S)。 A.2PVX：马铃薯X病毒(PotatovirusX）。 A.3PVM:马铃薯M病毒(Potatovirus M)。 A.4PVY:马铃薯Y病毒(PotatovirusY)。 A.5PLRV:马铃薯卷叶病毒(Potatoleaf-rollvirus)。 A.6PVA：马铃薯A病毒(PotatovirusA）。 A.7 DEPC:焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate)。 A.8dNTP：脱氧核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)。 A.9 EB:溴化乙锭(ethidium bro