ICS 67.060 X 11 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2638-2014 稻米及制品中抗性淀粉的测定 分光光度法 Determination of resistant starch in rice and products- Spectrophotometry method 2014-10-17 发布 2015-01-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 2638—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。 本标准起草单位：中国水稻研究所、农业部稻米及制品质量监督检验测试中心。 本标准主要起草人：方长云、徐霞、朱智伟、段彬伍、陈能。 NY/T 2638—2014 稻米及制品中抗性淀粉的测定 分光光度法 1范围 本标准规定了稻米及制品中抗性淀粉测定的分光光度法。 本方法适用于抗性淀粉含量2%～64%的稻米及制品的测定， 2规范性引用文件 下列文件对本文件的引用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 用α-胰腺淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶将试样中非抗性淀粉水解为葡萄糖，然后加入乙醇，经离心获 得抗性淀粉颗粒，将之溶于氢氧化钾溶液，用淀粉葡萄糖苷酶水解成葡萄糖后，与葡萄糖氧化酶一过氧 化物酶反应产生显色复合物，在510nm测定其吸光度值，吸光度值与抗性淀粉含量成正比。 4试剂 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水为GB/T6682规定的三级水。 4.1氢氧化钠(NaOH)。 4.2氢氧化钾（KOH)。 4.3二水合氯化钙(CaCl2·2H2O)。 4.4叠氮化钠（NaN）。 警告一一叠氮化钠为剧毒物品，操作不当可引起爆炸。 4.5磷酸二氢钾（KH2PO4）。 4.6盐酸(HCI)。 4.7马来酸(CHO）。 4.8苯甲酸(C,H.O2)。 4.94-氨基安替比林(CH13N:O)。 4.10对羟基苯甲酸(C,H.Os）。 4. 11 乙醇(CH;CH2OH)。 4. 12 冰乙酸(CH:COOH)。 4.13α-胰腺淀粉酶。 4.14葡萄糖氧化酶。 4.15过氧化物酶。 4.16D-葡萄糖标准品(CsH12O，纯度:99.5%)。 4.17氢氧化钠溶液[c(NaOH)=4.0mol/L]：称取160.0g氢氧化钠加适量水溶解后定容至1000 mL. 4.18氢氧化钠溶液[c(NaOH)=2.0mol/L]：称取80.0g氢氧化钠加适量水溶解后定容至1000mL。 1 NY/T2638—2014 4.19氢氧化钾溶液[c（KOH)=2.0mol/L]：称取112.2g氢氧化钾加适量水溶解后定容至1000mL。 该溶液在室温下可保存12个月。 4.20盐酸溶液Lc（HCl）=2.0mol/L]：量取180.0mL盐酸，加适量水并稀释至1000mL。 4.21苯甲酸溶液[c(C.H,COOH)=0.2%]：称取0.2g苯甲酸溶于水定容至100mL。 4.22马来酸钠缓冲液Lc(C,H0,COONa）=100mmol/L，pH6.0］：称取23.2g马来酸溶于1600mL 水中，用氢氧化钠溶液（4.17)调至pH为6.0,然后加人0.6g二水合氯化钙和0.4g叠氮化钠，最后定 容至2000mL。该溶液在4℃可保存12个月。 4.23乙酸钠缓冲液Lc(CHsCOONa)=1.2mol/L，pH3.8]：量取70mL冰乙酸至800mL水中，用氢 氧化钠溶液（4.17)调至pH为3.8,最后定容至1000mL。该溶液在室温下可保存12个月。 氢氧化钠溶液（4.17)调至pH为4.5，最后定容至1000mL。该溶液可在4℃保存2个月。 4.25乙醇溶液[c(CH;CH2OH)=50%，体积分数］：500mL无水乙醇加水定容至1000mL。该溶液 在室温下可保存12个月。 4.26淀粉葡萄糖苷酶原液AMG（3300U/mL）：直接购买使用。该溶液在4℃可保存5年。 4.27淀粉葡萄糖苷酶使用液（300U/mL）：吸取2.0mLAMG(4.26)用马来酸钠缓冲液（4.22)稀释至 22mL，分装于聚丙烯塑料管，放于一20℃保存。 4.28α~胰腺淀粉酶悬浮液[10mg(30U/mL)+AMG(3U/mL)]：称取1.0gα-胰腺淀粉酶溶于100 ml马来酸钠缓冲液（4.22）中，搅拌5min。加人1.0mL淀粉葡萄糖苷酶使用液（4.27），混匀后， >1500g离心10min，取上清液。该溶液现配现用。 4.29GOPOD-一氨基安替比林储备液：称取136.0g磷酸二氢钾，42.0g氢氧化钠和30.0g对羟基苯 甲酸至900mL水中溶解，用盐酸溶液（4.20）或氢氧化钠溶液（4.18)调节该溶液的pH至7.4.定容至 1000mL，加人1.0g叠氮化钠，溶解混匀。该溶液于4℃可保存3年。 1 000 mL. 4.31GOPOD一氨基安替比林混合液[葡萄糖氧化酶(>12000U/L)+过氧化物酶(>650U/L)+4- 氨基安替比林0.4mmol/Ll：称取300mg葡萄糖氧化酶、4mg过氧化物酶和80mg4-氨基安替比林混 合，溶于1000mLGOPOD一氨基安替比林缓冲液（4.30）中。此溶液需避光保存，一20℃可保存1年。 4.32D-葡萄糖标准储备液（1.0g/L）：称取1.00gD-葡萄糖（99.5%，无结晶水，分析纯）至900mL 苯甲酸溶液（4.21），定容至1000mL。室温下密封保存时间可保5年。 5仪器 5.1分光光度计。 5.2分析天平（±0.0001g）。 5.3离心机（3000g）。 5.4 pH计。 5.5组织捣碎机。 5.6水浴摇床：可设定为100次/min直线运动，振荡距离35mm。 5.7涡旋振荡器。 5.8磁力搅拌器。 5.9²磁力搅拌棒（5mmX15mm）。 5.10计时器。 2 NY/T 2638—2014 5.11水浴锅。 5.12磨粉机。 5.13温度计[(37±0.1)℃;(50±0.1)℃]。 5.14具螺旋盖塑料离心试管（16mmX125mm）。 5.15玻璃试管（16mm×100mm）。 6分析步骤 6.1试样制备 干试样：取代表性干样约50g，粉碎，过1.0mm筛，混匀后储于广口瓶中。 湿试样：取有代表性湿样于组织捣碎机中捣成匀浆备用。 6.2试液制备 做2份平行试液。准确称取于样100mg（土5mg）样品，湿样样品约0.500g于螺旋帽试管中，轻轻 拍打试管使样品集中在底部，加入4.0mLα-胰腺淀粉酶悬浮液，旋紧试管盖，置于涡旋振荡器混勾，卧 式放入水浴摇床（与运动方向平行），于37℃准确振荡16h。取出试管，擦去外表水分，开启试管盖，加 人4.0mL无水乙醇，涡旋，1500g离心10min（不加盖）。倾出上清液，加入2.0mL乙醇溶液，重悬浮， 涡旋振荡，再加人6.0mL乙醇溶液，混合后，1500g离心10min。弃去上清液，重复上述重悬浮和离心 步骤。弃去上清液，翻转试管，用滤纸吸除多余的液体。将试管置于冰水中，在各试管中放人磁力搅拌 棒并加人2.0mL氢氧化钾溶液（4.19），在冰水状态搅拌20min后，边搅拌边向各试管中顺序加入8.0 mL的乙酸钠缓冲液（4.23)和0.1mLAMG（4.26），混匀。取出试管，于50℃水浴30min，期间2次取 出试管涡旋振荡后迅速放回水浴中。对于抗性淀粉含量≥10%的样品，用水全部转移试管里的样品至 100mL容量瓶（当用洗瓶洗涤试管中的溶液时用外磁铁保持试管中的磁力棒），定容，备用。对于抗性 淀粉含量<10%的样品，直接离心。 6.3D~葡萄糖标准比色溶液 将0.1mLD-葡萄糖标准储备液（4.32)和3.0mL的GOPOD一氨基安替比林混合液（4.31)混合。 6.4空白溶液制备 在玻璃试管中加人0.1mL的乙酸钠缓冲液（4.24）和3.0mL的GOPOD一氨基安替比林混合液 (4.31)混合。 6.5试液的测定 将上述待测液（6.2)1500g离心10min。吸取上清液0.10mL置于玻璃试管，加入3.0mL GOPOD一氨基安替比林混合液（4.31），50℃水浴20min后取出，以空白溶液调零点，在510nm处测定 试液（6.2）和D-葡萄糖标准比色液（6.3)的吸光度值。 7结果计算 试样中抗性淀粉含量以质量分数w(g/100g，以干重计），计算按式（1）、式（2)进行计算。 抗性淀粉（g/100g样品）（含量≥10%） AAXFX100X100X162 0. 1 Xm X× 180 X1 000 (1) 抗性淀粉（g/100g样品）（含量<10%） AA X FX 10. 3 X 100 X 162 =m ..(2) 0.1XmX180X1000 式中： AA —一相对于空白试剂的吸光度值； 3 NY/T 2638-2014 F 从吸光度值到微克的转换[在GOPOD反应中100μgD-葡萄糖的吸光度值是确定 的，F=100(D-葡萄糖的微克数)/100μgD-葡萄糖在GOPOD反应中的吸光度］，单 位为微克（μg）； m 试样的质量，单位为毫克（mg）； 10.3 一含量<10%样品的最终体积，单位为毫升（mL）； 162/180—— 从测定获得的游离D-葡萄糖转换到淀粉中存在的无结晶水-D-葡萄糖的因子。 计算结果保留三位有效数字。 8精密度 当样品含量<2g/100g时，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于