ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 1187—2019 代替NY/T681—2003,NY/T1187—2006 鸡传染性贫血诊断技术 Diagnostic techniques for chicken infectious anemia 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 1187—2019 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准代替NY/T681—2003《鸡传染性贫血诊断技术》和NY/T1187—2006《鸡传染性贫血病毒聚 合酶链反应试验方法》。与NY/T681—2003、NY/T1187—2006相比，除编辑性修改外主要技术变化如 下： 增加了实验室检测技术部分荧光聚合酶链反应试验的检测方法。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心、山东农业大学。 本标准起草人：王传彬、顾小雪、赵鹏、张硕、韩雪、任志浩、蒋菲、宋晓晖、杨林、刘洋、刘玉良、王睿男、 毕一鸣。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -NY/T681—2003; -NY/T1187—2006。 NY/T 1187—2019 鸡传染性贫血诊断技术 1范围 本标准规定了鸡传染性贫血（CIA)临床诊断和病毒分离与鉴定、酶联免疫吸附试验、免疫酶试验、聚 合酶链反应试验和荧光聚合酶链反应试验及综合判定技术。 本标准适用于鸡传染性贫血的诊断、监测、产地检疫及流行病学调查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 鸡传染性贫血chickeninfectiousanemia 鸡贫血因子病 由鸡贫血病毒引起的维鸡再生障碍性贫血、全身淋巴组织萎缩、皮下和肌肉出血为特征的一种免疫抑 制性疾病。 4 缩略语 DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction) Tag酶：TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase) 5临床诊断 5. 1 流行病学 5.1.1本病各品种、年龄的鸡均易感，自然发病多见于2周龄～4周龄鸡。 5.1.2成年鸡或有母源抗体的维鸡感染无明显临床症状。 5.1.3种鸡感染后，可通过种蛋垂直传播给下一代。 5.1.4当有马立克氏病、传染性法氏囊病、禽网状内皮组织增殖症等免疫抑制性疾病发生时，维鸡对鸡传 染性贫血病毒(CIAV)的易感性增高,发病早且严重。 5.2 临床症状 雏鸡感染CIA的主要临床特征是贫血、病鸡精神沉郁、虚弱、消瘦，聚堆及行动迟缓，羽毛蓬乱，喙、肉 、面部和可视黏膜苍白，羽毛囊有淤血和出血性病灶，生长不良。 5.3病理变化 5.3.1病鸡表现再生障碍性贫血、消瘦，骨髓被脂肪组织取代呈黄白色，肌肉及内脏器官苍白，肝脏、肾脏 1 NY/T 1187—2019 肿大并褪色，血液稀薄，凝血时间延长，红细胞压积下降。 5.3.2病鸡表现全身性淋巴组织萎缩，胸腺、法氏囊、脾脏和盲肠扁桃体以及其他组织内淋巴细胞严重缺失。 5.4结果判定 例，应进行实验室确诊。 6 实验室诊断 6.1病原分离鉴定 6.1.1试剂或材料 6. 1. 1. 2 新生牛血清。 6. 1. 1.3 .链霉素100001g/ 6. 1. 1.4 淋巴细胞 6.1. 1.5标准阳性血清:用 CIAV抗原免疫SPF鸡制备的血清 6. 1.1.6 鸡血清 6. 1. 1.7 6.1.1.8吸管 6.1.1.9离心机及离心管 6. 1. 1. 10 研磨器械R 6. 1. 1. 11 6. 1. 1. 12 0. 45um微孔滤膜 6.1.2仪器设备 6.1.2.1二氧化碳培养箱 6.1.2.2恒温水浴 6.1.2.3普通冰箱及 低温冰 6.1.2.4倒置显微镜 6.1.3样品 按NY/T541无菌采集病鸡胸腺、骨髓、脾脏盲肠扁桃体、肝脏、肺脏、法氏囊等器官组织1g~2g， 研磨后用无血清DMEM(高糖)培养基制成20%组织悬浮液，以3000g离心30min。取上清液，70℃水 浴处理5min后加等量（体积比）10%三氯甲烷室温处理15min，10000g离心20min，取上清液用于CI- AV分离。 6.1.4操作方法 6.1.4.1用MDCC-MSB1细胞在含15%新生牛血清的DMEM(高糖)培养基、39℃和5%二氧化碳恒温 培养箱中培养。每2d~3d传代一次，细胞长至2×105个/mL～5×105个/mL。 6.1.4.2将0.1mL处理好的组织悬浮液接种上述培养的MDCC-MSB1细胞，在39℃和5%二氧化碳环 境下培养48h，观察结果。CIAV感染后的细胞病变表现为细胞体积增大，随后溶解。若第一次接种未出 现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代。 6.1.4.3将出现病变的细胞用6.3、6.4、6.5的任意一种方法进行鉴定。 6.1.5结果判定 a）CIAV分离鉴定阳性：出现病变的细胞用6.3、6.4、6.5的任意一种方法检测为阳性。 CIAV分离鉴定阴性：样品接种细胞后盲传三代均无细胞病变，或者用6.3、6.4、6.5三种方法检 测均为阴性，则判为阴性。 2 NY/T 1187--2019 6.2酶联免疫吸附试验 6.2.1试剂或材料 6.2.1.1酶标板：用CIAV抗原包被的酶标板。 6.2.1.2标准阳性血清：用CIAV抗原免疫SPF鸡制备的血清，SPF鸡应符合GB/T27401的规定。 6.2.1.3标准阴性血清：SPF鸡血清。 6.2.1.4酶结合物：HRP标记抗CIAV单克隆抗体。 6.2.1.5磷酸盐缓冲液(PBS)：配制见A.2。 6.2.1.6洗涤液：配制见A.3。 6.2.1.7样品稀释液：配制见A.4。 6.2.1.8底物溶液：配制见A.5。 6.2.1.9终止液：配制见A.6。 6.2.1.10可调移液器（最大量程为50μL、200μL、300μL)及相应吸头。 6.2.2仪器设备 酶联检测仪。 6.2.3样品 采集被检鸡血液，分离血清。血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，立即送检或于 一20℃保存。试验前，将被检血清统一编号，并用样品稀释液作10倍稀释。 6.2.4操作方法 6.2.4.1取出酶标板，并将样品位置记录在记录单上。向A1和B1孔中分别加入100μL未经稀释的阴 性对照血清,C1和D1孔中分别加人100μL未经稀释的阳性对照血清,其他各孔中加人100μL稀释好的 待检样品，每一样品加2孔。 6.2.4.2置室温1h。用洗涤液将反应板洗涤3次～5次。 6.2.4.3每孔加人100μL酶结合物。置室温30min。 6.2.4.4用洗涤液将反应板洗涤3次～5次。 6.2.4.5 5每孔加人100μL底物液。室温放置15min。 6.2.4.6 6每孔加入100μL终止液，立即用酶标仪于波长650nm测定各孔OD值。 6.2.4.7也可采用等效的试剂盒操作。 6.2.5结果判定 6.2.5.1试验成立条件： a)1 标准阴性血清OD650≤0.6。 6) 标准阴性血清OD650 S_待检血清OD650 6.2.5.2 2计算待检血清SIN值： ：N=阴性血清ODes50 6.2.5.3结果判定： a）样品S/N≤o.6,判为CIAV抗体阳性。 b）样品S/N>0.6,判为CIAV抗体阴性。 6.3免疫酶试验 6.3.1试剂或材料 6.3.1.1抗原涂片的制备：MDCC-MSB1细胞在含15%胎牛血清DMEM培养基中培养。当细胞长至 5X105个/mL,接种CIAV,并换成含5%新生牛血清的DMEM培养基，培养36h～48h。病变50%~ 75%时，离心收集感染细胞，PBS洗涤3次后，稀释至细胞为1×106个/mL。取印有10个～40个小孔的 3 NY/T 1187—2019 箱式载玻片，每孔滴加10μL。室温自然干燥后，冷丙酮（4℃）固定10min。密封包装，置一20℃备用。 6.3.1.2标准阳性血清：用CIAV抗原免疫SPF鸡获得的血清。 6.3.1.3标准阴性血清：SPF鸡血清。 6.3.1.4酶结合物：HRP标记的抗鸡二抗。 6.3.1.5 磷酸盐缓冲液(PBS)：配制见A.2。 6.3.1.6 底物溶液：配制见A.7。 6.3.1.7 印有10个～40个小孔的箱式载玻片。 6.3.1.8可调移液器（最大量程为50pL）及相应吸头。 6.3.2仪器设备 6.3.2.1普通光学显微镜 6.3.3样品 透明、不溶血 存或立即送检。试验前，将被检血清统 编号，并用PBS作10倍稀释 RES 6.3.4操作方法 6.3.4.1取出抗原涂片C恢复到室温：滴加10倍稀释的待检血清和标准阴 标准阳性血清。每份 血清加2个病毒细胞孔和 1 个正常细胞孔，置湿盒内，37℃30min 6.3.4.2PBS漂洗3次，每次5min 6.3.4.4PBS漂洗3次 每次5min 6.3.4.5将室玻