ICS 65.020.20 B 61 LY 中 华 人 民 共 和 国 林业行 业 标 准 LY/T 3107—2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程 Technical regulati on for willow varieties identification by SSR markers （发布稿） 2019 - 10 - 23发布 2020 - 04 - 01实施 国家林业和草原 局 发布 LY/T 3107—2019 I 前 言 本标准按照 GB/T1.1 —2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由全国林木种子标准化技术委员会（ SAC/TC 115 ）提出并归口。 本标准主要起草单位：南京林业大学。 本标准参加起草单位：江苏省 林业科学研究院；山东省林业科学研究院。 本标准主要起草人： 李淑娴、戴晓港、尹佟明、陈赢男、刘德玺、何旭东 。LY/T 3107—2019 1 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程 范围 本标准规定了以柳属(Salix )植物 DNA为材料，利用微卫星标记 (microsatellite )对国家和省审 (认)定 的柳树品种进行分子鉴定 的规范化 操作技术。 本标准适用于附录 A中所列柳树品种的鉴别。 2 术语和定义 2.1 微卫星标记 microsatellite 微卫星标记，又被称为短串联重复序列 (short tandem repeats, STRs)或简单重复序列 (simple sequence repeats，简称 SSR)，是指基因组中由 2～6个核苷酸组成的 DNA串联重复序列。 2.2 基因型频率 genotype frequency 基因型频率指不同基因型在全部个体中所占的比率，全部基因型频率的总和为 1或100%。 3 操作程序 3.1 取样和保存 取柳树幼嫩叶片 5 片～10 片，用干燥硅胶密封保存，用于 DNA提取。 3.2 DNA提取所需试剂 a) 1 M Tris：称取 12.11 g Tris 溶解到 80 mL超纯水中，调节 pH=8.0，定容到 100 mL。 b) 0.5 M EDTA：称取 18.61 g EDTA溶解到 80 mL超纯水中，调节 pH=8.0，定容到 100 mL。 c) 5 M氯化钠：称取 23.38 g氯化钠溶解到 80 mL超纯水中，定容到 100 mL。 d) 5 M醋酸钾：称取 25.54 g醋酸钾， 200 mL超纯水溶解后定容到 250 mL。 e) 2% SDS：称取 1.0 g十二烷基硫酸钠 (SDS)，40 mL超纯水溶解后定容到 50 mL。 f) 10% CTAB： 称取 10 g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵 )溶解到 80 mL超纯水中， 定容 到100 mL。 g) 氯仿异戊醇： 240 mL氯仿， 10 mL异戊醇混合。 h) 70%乙醇： 70 mL乙醇，加入 30 mL超纯水。 i) CTAB裂解液：1 mL 1 M Tris(pH=8.0)，4 mL 0.5 M EDTA(pH=8.0) ，28 mL 5 M 氯化钠， 10 mL 10% CTAB，5 g聚乙烯吡咯烷酮，定容到 100 mL。 j) TBE缓冲液 (10×)：称取 108 g Tris 碱和 55 g硼酸，加入 40 mL 0.5 M EDTA 溶液（ pH=8.0） ，用LY/T 3107—2019 2 800 mL双蒸水溶解后定容到 1 L，高温灭菌 。 3.3 DNA提取 DNA提取采用改良的 CTAB法： a) 向2 mL离心管中加入 400 µ L CTAB裂解液， 10 µ L的10 mg/mL Rnase ，2 µL β -巯基乙醇 。 b) 取柳树叶片 3-5片，放入研钵中加入液氮充分研磨，将研磨后的样品转入 3.2.1的离 心管中， 涡旋混匀后， 65℃保温 10 min，再加入 400 µ L 2% SDS，涡旋混匀， 65℃保温 10 min。 c) 向3.2.2的离心管中加入 130 µL 5 M醋酸钾，涡旋混匀，将离心管插入冰中保存 10 min。 d) 加入 800 µL 氯仿异戊醇溶液 (氯仿 :异戊醇 =24:1)，涡旋混匀后， 12000 rpm离心 5 min。 e) 将上清液转移到新的 2 mL离心管中 ，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管 8-10次， -20℃冻 存20 min。 f) 取出离心管， 12000 rpm 离心 5 min，去除上清液。 g) 加入 500 µL的70%乙醇， 12000 rpm离心 2 min，去除上清液。 h) 重复 3.2.7步骤一次。 i) 加入 500 µL无水乙醇， 12000 rpm离心 5 min，去除上清液，离心管开盖室温放置 30 min。 j) 加入 100 µ L TE缓冲液， 37℃保存 5 min，涡旋混匀 获得 DNA，将样品放在 -80 ℃长期保存 。 3.4 DNA定量及质量检测 a) 取2 µ L DNA 用微量核酸蛋白检测仪检测，直接读出 DNA浓度和 A260/280 的比值。 b) 根据上述测定浓度，取 200 ng DNA，加入2 µ L溴酚蓝，在 1%的琼脂糖凝胶上电泳，加入 5000 bp marker 作对照，稳压 100 V，电泳缓冲液为 1× TBE，电泳结束后用凝胶成像系统记录拍照 。 c) 根据微量核酸蛋白检测仪的定量结果，将样品稀释成 20 ng/µ L，在 -20℃下保存备用 。 3.5 目的片段 PCR扩增 3.5.1 16对SSR引物及序列见附录 B。 3.5.2 目的片段扩增 反应体系为 15 µ L，具体试剂用量 见表 1。 表1 PCR 扩增反应体系 试剂 浓度 所需体积 (µ L) PCR buffer 10× PCR buffer(Mg2+ Plus) 1.5 Taq酶 5 U/µ L 0.2 Forward Primer 5 mM 1 Revere Primer 5 mM 1 DNA 20 ng/µ L 2 dNTP 5 mM 0.3 dUTP 250 nM 1 LY/T 3107—2019 3 H2O 6.8 3.5.3 PCR扩增反应 将配制的扩增体系 加入到 8连管或 96孔PCR板中，盖上管盖后 涡旋混匀， 在3000 rpm 下离心 5 s， 放入 PCR仪中扩增，扩增程序为： 1) 94 ℃变性 4 min； 2) 94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共35个循环； 3) 72 ℃延伸 10 min，15 ℃ 保存。 3.6 目的片段检测 3.6.1 PCR产物变性 PCR产物用双蒸水稀释 10-15倍，取1µL稀释产物 加入到 9 µL的Loading buffer (91% 超纯甲酰 胺， 9%内标 Genescan 500 Rox ) 后混匀；在PCR仪上运行变性程序： 95℃变性 5 min，迅速放冰上冷却 。 3.6.2 PCR扩增产物检测 PCR产物检测采用 ABI PRISM 3130xl 分析系统 。从数据采集 软件中创建一个片段分析程序，选择 片段分析模式以及光谱校正所用试剂盒类型。创建一个自动分析模板，填写分析样品名称，选择样品类 型、内标类型、分析方法等。 将变性的产物 转入 96孔PCR板，盖上仪器自带的 PCR板盖，放入仪器 中。在软件中将 PCR板链接到仪器，点击开始进行基因型分型。 3.6.3 PCR扩增产物 条带分析 采用基因型分析软件打开基因型分型的结果，根据内参大小直接读出每个样品目的片段的大小。 4 送检样品分析 送检样品分析程序为： a) 随机选取附录 B.1中的一对SSR引物，对待检样品进行 PCR扩增。 b) 将待检样品 扩增得到的条带和附录 C.1-C.2中对应引物的 标准谱带相比较 。 c) 如果所有 扩增条带和附录 C.1-C.2中对应引物某一品种的 标准谱带 完全相同，即判定为相同品 种；如果扩增条带和其中几个品种的条带完全相同，则增加一对引物进行检测，直至检测到唯 一匹配的品种。 d) 如果待检样品 所有扩增条带有一个以上位点与标准谱带不同，即判定为不同品种 。 e) 根据基因型频率判定所鉴定品种真实性的准确率，见附录 D。 LY/T 3107—2019 4 附录 A （资料性附录） 本标准适用鉴定 的柳树品种表 表A.1 本标准适用鉴定的柳树 品种 序号 品种中文名 拉丁名 1 苏柳 172 Salix jiangsuensis CL ‘J172’ 2 苏柳 485 S. jiangsuensis CL ‘485’ 3 苏柳 52-2 S. jiangsuensis CL ‘52 -2’ 4 苏柳 795 S. jiangsuensis CL ‘J795’ 5