ICS 11.220 CCS B 41 54 西 藏 自 治 区 地 方 标 准 DB54/T 0462—2025 羊传染性脓疱病诊断技术规范 2025 - 05 - 10发布 2025-06 - 10实施 西藏自治区市场监督管理局   发 布 DB54/T 0462—2025 I目 次 前言..................................................................................II 1 范围................................................................................1 2 规范性引用文件......................................................................1 3 术语和定义..........................................................................1 4 生物安全措施........................................................................2 5 临床诊断............................................................................2 6 病毒分离培养........................................................................3 7 分子生物学诊断......................................................................4 8 综合判定............................................................................5 附录A（资料性） 相关症状图片..........................................................6 附录B（资料性） 聚合酶链式反应(PCR)产物电泳图.........................................9 附录C（资料性） 实时荧光定量PCR结果图...............................................10DB54/T 0462—2025 II前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所提出。 本文件由西藏农业农村标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所、云南农业大学。 本文件主要起草人：四朗玉珍、富国文、格桑卓嘎、班旦、樊月圆、拉巴次旦、吴金措姆。DB54/T 0462—2025 1羊传染性脓疱病诊断技术规范 1　范围 本文件提出了羊传染性脓疱病的生物安全措施、临床诊断、病毒分离培养、分子生物学诊断技术要 求。 本文件适用于羊传染性脓疱病的诊断。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 NY/T 3235 羊传染性脓疱诊断技术 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　 羊传染性脓疱病 亦称羊口疮、羊传染性脓疱皮炎、羊传染性脓疱口炎，由羊传染性脓疱病毒导致的山羊、绵羊接触 性、嗜上皮性传染病。 3.2　 聚合酶链式反应 英文全称Polymerase Chain Reaction，缩写为PCR，由引物选择性体外扩增DNA或RNA片段的检测方 法。 3.3　 双蒸水 双蒸水，是重蒸水的一种，是将经过一次蒸馏后的水再次蒸馏所得到的水（二级水）。 3.4　 聚合酶链式反应预混液 英文名称PCR Master Mix，PCR试验时使用的预混物。DB54/T 0462—2025 23.5　 DNA标记物 英文名称DNA Marker，特定分子量大小的DNA片段混合物，用于估算样品DNA分子量的大小。 3.6　 荧光定量PCR探针法 除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光基团和淬灭基团，此时，两个基团平衡 不发光；当DNA通过引物合成时，探针被折断，释放出发光基团和淬灭基团，两个距离较远，发光基团 产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量。 3.7　 循环阈值 也称Ct值，在荧光定量PCR中，每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数。 4　生物安全措施 样品采集及处理的生物安全措施按GB 19489 的规定执行。 5　临床诊断 5.1　流行病学 绵羊和山羊均易感，各年龄段的羊均可发病，以1月龄～6月龄多发，成年羊呈散发。除能感染羊外， 该病毒对其他反刍动物和人类也具有感染能力。 一年四季均可发病，常呈群发性流行。自然放牧条件下，冬春季节多发。 病羊是该病的主要传染源，受到污染的圈舍、栏杆、垫草、饲槽以及饲草等都存在病毒，可经皮肤 黏膜损伤处感染其他羊。 5.2　临床症状 5.2.1　唇型 唇型的临床症状及病理变化表现为上唇、 鼻镜、 口角等部位出现小红疹， 逐渐演变为小结节和疣状， 最后破溃形成硬痂，症状见附录A.1。 5.2.2　蹄型 蹄型多见于绵羊，常表现为一肢患病，其临床症状及病理变化表现为蹄叉、蹄冠、系部皮肤出现水 疱、脓疱，破溃后形成溃疡，症状见附录A.2。 5.2.3　外阴型 外阴型较少见，母羊临床特征及病理变化主要表现为有脓性或黏性阴道分泌物，阴唇及周围皮肤有 溃疡，症状见附录A.3；公羊出现阴鞘肿胀、脓疱、溃疡。DB54/T 0462—2025 35.2.4　乳房型 乳房型表现为乳头和乳房皮肤出现脓疱，后形成痂垢，症状见附录A.4。 5.2.5　其他类型 体表皮肤感染临床症状与病理变化与唇型相似。 小肠和肠系膜感染其临床特征及病理变化主要表现 为体温升高大于39.5℃、精神萎靡、腹腔积液，小肠浆膜表面出现黄白色溃疡灶，肠系膜上出现大小不 一的圆形或椭圆形脓疱，病理变化见附录A.5。 5.3　结果判断 根据临床症状，可判定为羊传染性脓疱病疑似病例。 6　病毒分离培养 6.1病料采集、处理及运输 6.1.1痂皮 采集发病羊患处痂块0.5 g～1.0 g， 用无菌生理盐水漂洗3次后剪碎， 研磨并以无菌生理盐水按1: 10 制成悬液，加青霉素、链霉素各2000 IU/mL，置4 ℃冰箱过夜，3000 r/min、离心l0 min，取上清，当 日不能送到实验室诊断，则样品于-20 ℃保存，再送检，运输中保证密封、低温状态。 6.1.2水泡液 用无菌注射器抽取丘疹水泡液，置于含2倍体积无菌生理盐水中的灭菌离心管中，加青霉素、链霉 素各2000 IU/mL，3000 r/min 离心l0 min，取上清，当日不能送到实验室诊断，则样品于-20 ℃保存， 再送检，运输中保证密封、低温状态。 6.2主要仪器设备 高速冷冻离心机、生物安全柜、CO 2培养箱、倒置显微镜、透射电子显微镜、紫外灯、冰箱、可调 微量移液器20 µL～200 µL、200 µL～1000 µL。 6.3试剂耗材 细胞培养液（含DMEM细胞培养液90%、胎牛血清10%、青霉素100 IU/mL和链霉素100 mg/ mL构成）、 细胞维持液（含DMEM细胞培养液98%、胎牛血清2%、青霉素100 IU/mL和链霉素100 mg/ mL构成） 、25 cm2 细胞培养瓶、0.22 µm滤器、15 ml离心管、滤纸、碳支持膜铜网、2%磷钨酸、无菌移液器枪头20 µL～ 200 µL、200 µL～1000 µL。 6.4细胞制备 犊牛睾丸原代细胞、犊牛肾原代细胞或羊皮肤细胞任一种，制备方法参照NY/T 3235执行。 6.5细胞处理方法 待6.4中的细胞长成良好的单层后，倒掉细胞培养液。将6.1.1或6.1.2中病料处理液用0.22µm滤器 过滤，取1 ml接种于细胞表面，37 ℃吸附1 h。吸出病料处理液，加入细胞维持液4 mL，置37 ℃、5% CO 2 培养箱中培养。DB54/T 0462—2025 4将出现病变的细胞与培养液一起反复冻融3次，吸出，置于15 ml离心管中，3000 rpm离心30 min， 取上清滴于碳支持膜铜网上，3 min～5 min后用滤纸吸去多余液体，再将2%磷钨酸滴于碳支持膜铜网上， 2 min～3 min后用滤纸吸去多余液体，室温放置干燥，置于透射电子显微镜下观察。 6.6判定 每天观察细胞变化，连续观察5 d。如6.4中细胞在接种后1 d～5 d内出现变圆、肿胀、间质增宽、 折光性增强、团聚、脱落等细胞病变，于透射电子显微镜下观察到椭圆形病毒粒子，长250 nm～ 280 nm，宽170nm ～200 nm，判为病毒分离阳性。盲传3代无细胞病变，则判为病毒分离阴性。 7　分子生物学诊断 7.1　样品DNA提取 取6.1