ICS 65.020.30 CCS B 41 54 西 藏 自 治 区 地 方 标 准 DB54/T 0450—2025 藏猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测 技术规范 2025 - 05 - 10发布 2025-06 - 10实施 西藏自治区市场监督管理局   发 布 DB54/T 0450-2025 I目 次 前言..................................................................................II 1 范围................................................................................1 2 规范性引用文件......................................................................1 3 术语和定义..........................................................................1 4 缩略语..............................................................................1 5 仪器和设备..........................................................................2 6 试剂和耗材..........................................................................2 7 样品采集和处理......................................................................2 8 核酸提取............................................................................3 9 荧光定量RT-PCR操作程序.............................................................3 10 结果判定...........................................................................3 11 生物安全措施.......................................................................4 附录A（规范性） 试剂的配置............................................................5 附录B（规范性） 荧光定量PCR引物和Taqman探针的名称和序列.............................6 附录C（规范性） 荧光定量PCR反应体系和条件............................................7DB54/T 0450-2025 II前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由西藏自治区农业农村标准化技术委员会提出并归口。 本文件起草单位：西藏农牧学院、华中农业大学、甘肃农业大学、西藏自治区动物疫病预防控制中 心、林芝市畜牧兽医总站、昌都市畜牧总站。 本文件主要起草人：罗润波、商鹏、邢紫慢、孙煜、金卉、罗锐、甘富斌、张丽鸿、格桑卓玛、张 辉、拜占春、韦明邦、蔡重振、钟亚男、李可欣、普布扎西、赵红阳、李沛明、石斌。DB54/T 0450-2025 1藏猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测技术规范 1　范围 本文件规定了藏猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测方法的仪器和设备、试剂和耗材、样品采集 和处理、核酸提取、荧光定量RT-PCR操作程序、结果判定及生物安全措施等要求。 本文件适用于藏猪肠道内容物、粪便、肠道组织样品中猪流行性腹泻病毒的定性及定量检测。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本 文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 SN/T 4835 实验室生物废弃物管理要求 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　 逆转录聚合酶链式反应 采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶将RNA逆转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获 得目的基因或检测基因表达。 3.2　 荧光定量PCR 指在PCR反应体系中加入荧光基团、利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，实现对未知模板的定 性及定量分析。 3.3　 循环阈值 是每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 4　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PEDV：猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus）。 DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethyl Pyrocarbonate）。 PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Solution）。 PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）。DB54/T 0450-2025 2RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）。 RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid）。 cDNA：互补脱氧核糖核酸（Complementary Deoxyribonucleic Acid）。 FAM：荧光素酰胺（Fluorescein Amidite）。 TAMRA：四甲基罗丹明（Tetramethylrhodamin）。 Ct值：循环阈值（Cycle threshold）。 ddH2O：双蒸水（Double Distilled Water）。 5　仪器和设备 荧光定量PCR仪、高速冷冻离心机、组织研磨器或者研钵、高压灭菌锅、生物安全柜、分析天平、 各型号微量移液器、容量瓶、制冰机等。 6　试剂和耗材 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器分装，实验室 用水符合GB/T 6682的要求。 a)无RNA酶的1.5 mL离心管。 b)无RNA酶的200μLPCR管或八联管。 c)无RNA酶的各种规格的吸头。 d)商品化的病毒组RNA提取试剂盒。 e)商品化的RT-PCR反应试剂盒。 f) 2× AceQ Universal U+ Probe Master Mix V2。也可购买其他商品化探针法荧光定量PCR 试剂。 g) DEPC水配置，见附录A。也可购买商品化DEPC水。 h) PBS（0.01 mol/L，pH7.4）配置，见附录A。也可购买商品化PBS。 i)荧光定量PCR引物和TaqMan探针，序列见附录B。 j)阳性质粒，由NCBI数据库参考菌株PEDV GD-XL-2019毒株（GenBank：MN759311）的M 基因构建的阳性质粒pCAGGS-M。工作浓度不低于105 copies/μL。 k)阴性对照为DEPC水。 7　样品采集和处理 7.1　采集工具 下列采样工具适用于本文件。 a)剪刀、镊子、手术刀，经121℃，30 min高压蒸汽灭菌并烘干。 b)组织研磨器或研钵，经170℃干热灭菌2h。 c)无菌采样拭子、采样管，为一次性用品。 7.2　样品采集 7.2.1　粪便或肠道内容物的采集DB54/T 0450-2025 3将无菌采样拭子经无菌PBS润湿后，深入肛门采集粪便样品或肠道内容物，采取量应≥0.5g，于无 菌采样管中编号保存。 7.2.2　组织样品的采集 用灭菌器械，剪取肠道组织，样品量≥5g，于无菌采样管中编号保存。 7.3　样品保存与运输 上述采集的样品应立即进行检测。不能立即检测的样品，在4℃条件下保存不超过24 h，-20℃条件 下保存不超过1个月，-80℃条件下保存不超过6个月。样品采用低温运输，符合NY/T 541的有关规定。 7.4　样品处理 7.4.1　粪便或肠道内容物的处理 取0.5g～2g粪便样品或肠道内容物，加500μL无菌PBS，混匀后置于-80℃冰箱反复冻融2次～3次， 待解冻后，充分混匀，于4℃，12 000 r/min离心5 min，将上清液转移到1.5 mLEP管中，编号，用于后 续核酸提取。 7.4.2　组织样品的处理 取1g～2g的组织， 剪碎后加入1mL无菌PBS进行研磨， 制备组织匀浆。 将制备好的组织匀浆置于-80 ℃ 冰箱反复冻融2次～3次，待解冻后，于4 ℃，12 000 r/min离心5 min，将上清液转移到1.5 mLEP管中， 编号，用于后续核酸提取。 8　核酸提取 取7.4中处理后的上清液提取RNA，RNA提取采用商品化的病毒组R