ICS 65.020.30 CCS B 41 54 西 藏 自 治 区 地 方 标 准 DB54/T 0449—2025 藏猪副猪嗜血杆菌、 多杀性巴氏杆菌和胸膜 肺炎放线杆菌三重实时荧光定量PCR检测 技术规范 2025 - 05 - 10发布 2025-06 - 10实施 西藏自治区市场监督管理局   发 布 DB54/T 0449—2025 I目 次 前言..................................................................................II 1 范围................................................................................1 2 规范性引用文件......................................................................1 3 术语和定义..........................................................................1 4 缩略语..............................................................................1 5 仪器和设备..........................................................................2 6 试剂和耗材..........................................................................2 7 样品采集和处理......................................................................2 8 核酸提取............................................................................3 9 三重实时荧光定量PCR检测............................................................3 10 结果判定...........................................................................3 11 生物安全措施.......................................................................4 附录A（规范性） 培养基及溶液配置......................................................5 附录B（规范性） 阳性质粒的构建........................................................6 附录C（规范性） 荧光定量引物、Taqman探针名称及序列...................................7 附录D（规范性） 荧光定量PCR反应体系及条件............................................8DB54/T 0449—2025 II前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由西藏自治区农业农村标准化技术委员会提出并归口。 本文件起草单位：西藏农牧学院、江苏农牧科技职业学院、泰州市姜堰区三水街道畜牧兽医站、昌 都市畜牧总站。 本文件主要起草人：罗润波、封琦、吴双、朱勇、韦创创、朱善元、商鹏、郑凯毅、普布扎西、赵 红阳、李沛明、张辉、拜占春、韦明邦、李可欣、钟亚男、石斌。DB54/T 0449—2025 1藏猪副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌三重实时 荧光定量PCR检测技术规范 1　范围 本文件规定了藏猪副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌三重实时荧光定量PCR检测 方法的仪器和设备、试剂和耗材、样品采集和处理、核酸提取、三重实时荧光定量PCR检测、结果判定、 生物安全措施等要求。 本文件适用于藏猪肺部组织、鼻腔或上呼吸道气管分泌物中的副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸 膜肺炎放线杆菌的定性及定量检测。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本 文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 SN/T 4835 实验室生物废弃物管理要求 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　 实时荧光定量PCR 指在PCR反应体系中加入荧光基团、利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，实现对未知模板的定 性及定量分析。 3.2　 循环阈值 是每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 4　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 HPS：副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）。 PM：多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）。 APP：胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）。 BHQ1：黑洞淬灭剂-1（Black Hole Quencher-1）。DB54/T 0449—2025 2BHQ2：黑洞淬灭剂-2（Black Hole Quencher-2）。 FAM：一种在荧光定量PCR中常用的荧光探针（Fluorescein Amidite）。 CY5：一种在荧光定量PCR中常用的荧光探针（Cyanine5）。 VIC：一种在荧光定量PCR中常用的荧光探针（View It Compounds）。 FBS：胎牛血清（Fetal Bovine Serum）。 NAD：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide）。 ROX：一种惰性参比染料（6-Carboxy-X-Rhodamine）。 Taqman探针：一种双标记的寡核苷酸水解探针（Taqman Probe）。 TE缓冲液：Tris-EDTA缓冲液（Tris-EDTA buffer）。 TSB：胰蛋白胨大豆肉汤培养基（Trypticase Soy Broth）。 ddH2O：双蒸水（Double Distilled Water）。 5　仪器和设备 荧光定量PCR仪、高速台式冷冻离心机、高压灭菌锅、生物安全柜、分析天平、各型号微量移液器、 容量瓶、气浴恒温振荡器等。 6　试剂和耗材 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水符合GB/T 6682的要求。 a)商品化FBS。 b) NAD贮存液配制，见附录A。 c)增菌培养液配制，见附录A。 d) 2×PerfectStart® II Probe qPCR SuperMix UDG，也可选择其他商品化2×荧光定量PCR 预混液。 e) 50×Passive Reference Dye，也可选择其他商品化50×ROX参比染料。 f) EASYDilution（forRealTimePCR，TakaraClontech），也可选择其他用于荧光定量PCR 的商品化DNA稀释液。 g)阳性质粒，见附录B。 h)阴性对照为无菌ddH 2O。 i)商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒。 j)引物及Taqman探针，见附录C。 k)无菌0.2mL荧光定量PCR管或八联管及各种规格微量移液器吸头。 l)无菌1.5mL棕色避光离心管。 m) 10mL一次性摇菌管。 7　样品采集和处理 7.1　采样工具 下列采样工具适用于本文件。 a)剪刀、镊子、手术刀，经121℃，30min高压蒸汽灭菌并烘干。 b)无菌采样拭子、采样管为一次性用品。DB54/T 0449—2025 37.2　样品采集 7.2.1　组织样品 用灭菌器械，剪取典型病变的肺部新鲜组织，样品量≥5g，于无菌的采样管中编号保存。 7.2.2　棉拭子样品 将无菌棉拭子经PBS湿润后插入藏猪鼻腔内2cm～3cm处，并轻轻旋转3次～5次，折断后浸泡于盛有 2.5mL增菌培养基的一次性摇菌管中。 7.3　样品保存与运输 上述采集的样品应立即进行检测。不能立即检测的样品，在4℃条件下保存不超过24h，-20℃条件 下保存不超过1个月，-80℃以下条件保存不超过6个月。样品采用低温运输，符合NY/T 541的有关规定。 7.4　样品处理 7.4.1　组织样品处理 取0.5 g～1 g的组织，将样品接种到盛有2.5mL增菌培养基的一次性摇菌管中，将摇菌管置于37℃， 210r/min，恒温震荡培养16h～24h。 7.4.2　棉拭子样品处理 吸取7.2.2中混有棉拭子样品的培养基100μL，接种到盛有2.5mL增菌培养基的一次性摇菌管中，将 摇菌管置于37℃，210 r/min，恒温震荡培养16h