ICS 65. 020 CCS B 62 DB53 云南省地 标准 DB53/T 1340—2025 香石竹品种真实性鉴定SNP分子标记法 2025 -01 - 08 发布 2025 -04- 08 实施 云南省市场监督管理局 发布 DB53/T 1340—2025 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所提出。 本文件由云南省农业标准委员会（YNTCO7）归口。 本文件负责起草单位：云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所、昭通学院、云南省种子管理 站、缤纷园艺（中国）有限公司、成都瀚辰光翼科技有限责任公司。 本文件主要起草人：赵秦、刘艳芳、王世敏、汤娅、沈任飞、乔菊香、姚宗泽、滕彩玲、杨晓洪、 刘天平、杨栗洁、毛进。 I DB53/T 1340—2025 香石竹品种真实性鉴定 SNP分子标记法 1范围 本文件规定了利用单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）分子标记进行香石 竹（Dianthus caryophyllus L.）品种真实性鉴定的鉴定准备、操作流程、数据分析、判定等技术内容 本文件适用于香石竹品种的真实性鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid) KASP：竞争性等位基因特异性PCR（kompetitive allele specific PCR) PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） SNP：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism) Taq酶：耐热DNA聚合酶（Taq-DNA polymerase） TE：三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA）。 Tris：三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane THAM) 5鉴定准备 5.1仪器设备 仪器设备有电泳仪、电泳槽及配套的制胶附件、水平电泳槽及配套的制胶附件、高速冷冻离心机（转 速≥12000 r/min）、微量移液工作站或微量移液器、水浴锅、超微量分光光度计（波长定点扫描230 nm、 260 nm和280 nm）、组织研磨仪、分析天平（感量≥0.01g）、pH计、涡旋混合器、高压灭菌锅、用于KASP 检测的仪器设备、低温冰箱等。 5.2试剂 1 DB53/T 1340—2025 5.2.1除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682规定的一级水。 5.2.2此外还包含但不限于CTAB[C16H3a(CH3):NBr,CAS 号:57-09-0]、三氯甲烷(CHC13,CAS 号:67-66-3)、 异戊醇（CsH20，CAS号：123-51-3）、异丙醇（C:H:0，CAS号：67-63-0）、乙二胺四乙酸二钠（CioHi4N2Na20s， CAS 号：139-33-3）、三羟甲基氨基甲烷[NH2C(CH20H)3，CAS 号：77-86-1]、氢氧化钠（NaOH，CAS 号: 1310-73-2）、氯化钠（NaC1，CAS 号：7647-14-5）、无水乙醇（CH:CH20H，CAS 号：64-17-5）、盐酸（HC1, CAS 号：7647-01-0）、β-硫基乙醇（C2H:0S，CAS号：60-24-2）聚乙烯吡咯烷酮［（CHNO)n，CAS 号: 9003-39-8]。 5.3DNA提取液 5. 3. 1 0.5 mol. L-1 EDTA 溶液 称取186.1g乙二胺四乙酸二钠溶于800.0mL水中, Na0H调pH至8.0,加水定容至1000.0mL,121.0℃ DA 高压灭菌20 min。 5.3.2 1.0 mol. L-1 Tris-HCl 溶液 称取60.6 g三羟甲基氨基甲烷溶于400.0mL水中, ，加HC1调pH至8.0，加水定容至500 mL，121.0℃ 高压灭菌20.0 min。 5.3.3CTAB 提取液 5.3.3.1 分别称取 20.0 g CTAB和81.7 g氯化钠和 20.0 g 聚乙烯吡咯烷酮溶于约 700.0 mL 水中。 5. 3. 3. 2 加入 100. 0 mL 1. 0 mo1. LTris-HC 溶液、40.0mL0.5 EDTA溶液，加水定容至1000.0 mL。 5.3.3.3 ：121.0℃高压灭菌20.0min, 却后加入 20. 0 mL 摇匀备用。 5. 3. 3. 4 也可使用商品CTAB提取液。 准 准 5.3.4TE缓冲液 分别量取5.0mL浓度1.0mo HC1溶液和1.0mL浓度 0.5mol.L-"的 EDTA溶液，加水定 y 5.4KASP引物工作液 5.4.1 KASP 引物溶液 将附录A所示每个位点的三管引物干粉分别用超纯水溶解至100.0 μmol.L"作为工作液备用。 5.4.2 2xKASP Master Mix 试剂 包括TaqDNA聚合酶、带有荧光的接头序列、镁离子、四种脱氧核糖苷酸（dNTP），ROX内参荧光染料。 6 操作流程 6.1样品准备 从送检样品中随机取5株以上个体的叶片或其他等效组织，每个植株取的量相等。 6.2DNA提取 6.2. 1 采用 CTAB 法。 2 DB53/T 1340—2025 6.2.20.2g样品加液氮充分研磨，后移入2.0mL离心管中， 6.2.3每管加入400μL经65℃预热的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴45min～60min，每隔10min 颠倒混匀1次。 6.2.4取出离心管，冷却至室温。 6.2.5每管加入与 CTAB提取液等体积的三氯甲烷：异戊醇（24:1)混合液，轻缓颠倒混匀，12000 r/min 离心10 min。 6.2.6吸取上清液转移至新的离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置 30 min, 4℃、12 000r/min 离心10 min，推荐重复1次 6.2.7弃上清液，加入75%的乙醇500μL，洗涤沉淀两次。 6. 2.8 ：酒精充分挥发，加入 200 μL 双蒸水或 TE（pH 8.0）缓冲液充分溶解 DNA。 6. 2. 9 紫外分光光度计检测 DNA 浓度, ，OD260/0D280宜介于1.8～2.0之间，0D260/0D230大于2.0。 6. 2. 10 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量， 条带清晰， 将符合要求的 DNA 放置-20 ℃储存备用。 6. 2. 11 以上为推荐的一种 DNA 提取方法所获 DNA 质量能够符合 PCR 扩增需要的 DNA 提取方法都适用 于本文件。 6.3基因分型检测 6. 3. 1 引物序列 6. 3. 1. 1 推荐引物及其序列者 包括一组核心引物、 6. 3. 1. 2 先使用核心引物进行真实性判断， 若分型结果- 致，则使用其它引物进行判断。 6. 3. 1. 3 每个 SNP 位点有 条引物，分 分别是有2条正向带荧光标记的引物1（FAM）、引物2（HEX）， 3 和一个反向通用引物（Comm( 绿准化 标准 6. 3. 2 PCR反应及分型 PCR反应体系见表1。 PCR反应体系 组分 μL 2XKASP Master 2. 5 10 μM Primer F 0. 05 10 μM Primer R 0. 05 10 μM Primer Common 0. 06 ddHz0 0.34 DNA模板 2 Total 5 6. 3. 3 反应程序 反应程序见表2。