ICS 65. 020. 20 CCS B21 DB53 云南省地 标准 DB53/T 12762024 山药茎尖组织培养种苗繁育技术规程 2024－05－08 发布 2024-08-08 实施 云南省市场监督管理局 发布 DB53/T 1276—2024 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由云南农业大学提出。 本文件由云南省农业标准化技术委员会（YNTCO7）归口。 本文件起草单位：云南农业大学、富源县经济作物技术推广站、富源县谷子地种植农民专业合作社。 本文件主要起草人：龙雯虹、施令祥、段延碧、徐升胜、陈佩、兰平秀、王仕玉、郑玉屏、耿辉、 程园、敖纯。 I DB53/T 1276—2024 山药茎尖组织培养种苗繁育技术规程 1范围 本文件规定了山药(Dioscorea opposita)茎尖组织培养与脱毒试管苗繁育的设备设施、化学试剂、培 养基、茎尖组织培养、病毒检验、脱毒苗继代增殖培养、生根培养、苗炼苗等技术要求。 本文件适用于山药茎尖组织培养及脱毒试管苗繁育。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB19489实验室 生物安全通用要求 GB/T22278良好实验室规范原则 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 茎尖组织培养 Shoot tip culture 简称茎尖培养，切取茎尖分生组织，进行离体培养的过程。 3. 2 茎尖组培苗 Plantlets from shoot tip culture 切取茎尖分生组织进行离体培养后获得的组培苗，在本文件中特指经检测不携带山药斑驳病毒 （YMOV）、山药温和花叶病毒（YMMV）、日本山药花叶病毒（JYMV）和山药褪绿坏死病毒（YCNV）等病 毒病的山药组培苗。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 MS： MS培养基 （Murashige & Skoog medium) AC：活性炭（Activated carbon） 6-BA：6-基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine） NAA：萘乙酸（Naphthylacetic acid) RNA：核糖核酸（Ribonucleic acid) cDNA：互补脱氧核糖核酸（Complementary DNA） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction) ，实验室、仪器设备与试剂 1 DB53/T 1276—2024 5.1实验室 符合GB19489和GB/T22278的规定。 5.2仪器设备 高压灭菌锅、分析天平、空调、超净工作台、解剖镜、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、超纯水 机、接种针、手术刀、培养架、光温监控装置、紫外透射仪等。 5.3试剂 山药茎尖组织培养种苗快繁常用化学试剂类别和等级见附录A表A.1。病毒检测常用化学试剂见附录 A表A.2。 部 6培养基 管 6.1培养基配方 11 6.1.1诱导芽萌发培养基 MS + 6-BA 0. 5 mg/L + NAA 蔗糖30 g/ 10 12 g/L。 6.1.2 继代增殖培养基 方标准 MS + 6-BA 1 mg/L +NAA 0. 3 m 30g/ (琼脂7g/ 6.1.3生根培养基 MS + 6-BA 0. 5 mg/L + NAA 1 n mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂7g/L 准 6.2培养基配制 6.2.1诱导芽萌发培养基配制 各个成分按6.1.1中的配方量取， 用1 mol/L的NaOH或HC1将培养基的pH值调到5.8～ 6.0后分装到组培瓶中（培养基厚度为 为1cm）。 南 6.2.2继代增殖培养基配制 培养基的各个成分按6.1.2中的配方量取 加蒸馏水定容 用1 mol/L的NaOH或HC1将培养基的pH值 调至5.8～6.0后分装到组培瓶中（培养基厚度为1cm） 6.2.3生根培养基配制 培养基的各个成分按6.1.3中的配方量取，加蒸馏水定容，用1 mol/L的NaOH或HC1将培养基的pH值 调至5.8～6.0后分装到组培瓶中（培养基厚度为1cm）。 6.3培养基灭菌 将装有培养基的组培瓶放入高压灭菌锅，在温度121℃、压力0.105MPa的条件下保持20min。 7 茎尖组织培养 2 DB53/T 1276—2024 7.1母体选择 选择品种特征典型、表型稳定的植株，并进行标记。 7.2繁殖材料的采收保存 7.2.1被标记植株藤蔓上的珠芽（俗称零余子或山药蛋）成熟时，采收珠芽。 7.2.2或者当植株枯黄，地下块茎充分长大时，采收地下块茎。 7.2.3将采收的珠芽或块茎进行2 d～4d晾晒后，置于通风、干燥的室内保存。 7.3育苗与取材 7.3.1当珠芽萌芽时，将珠芽播种于底部有排水孔的托盘或盆里，盖上干净、疏松的基质，保持基质 湿润，放在25℃～30℃的条件下培养 晾晒茎段2d～4d，待切口愈合，将茎段放置到 底部有排水孔的托盘或盆里，盖 上基质，保持基质湿润， 放在 25℃～30℃的条件下培养。 7.3.3²待山药苗长至 20 cm～30cm高时, 切取顶部嫩芽 7.4消毒 7.4.1接种室 关闭门窗。 75%酒精室内喷雾，紫外线灯灭菌20min， 7. 4. 2 实验准备 7.4.2.1打开超净工作台紫外线灯灭菌 30 min。 7.4.2.2超净工作台开机过滤空气15 min 放入已灭菌的培 无菌水、培养皿、镊子、手术刀， 以及解剖镜、酒精灯、计时器、 记号笔等用具。 7.4.2.3解剖镜用 75%酒精喷雾 7.4.3材料消毒及剥取茎尖 7. 4. 3. 1 嫩芽用流动自来水冲洗后，放人消毒好的超净工作台。 7.4.3.2外植体用75%酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次一5次，0. 1%氯化汞溶液消毒5min～7min（或 用2%次氯酸钠浸泡15min），再用无菌水冲洗3次15次，放入 已灭菌的培养血中。 7.4.3.3在解剖镜下剥取直径0.3mm ～2个 个叶原基的茎尖。 7.5茎尖接种与转接 7.5.1将剥取好的茎尖接种到经过灭菌处理的6.1.1培养基上，迅速用瓶盖密封后于培养架上培养。 7.5.2培养期间30d～40d转接一次，将培养的茎尖更换到新鲜的已经灭菌的 6.1.1培养基上，直到 长成约 5cm～7cm高的苗。 7.6继代增殖培养 在超净工作台上，将7.5步骤得到的苗取出，切成带节茎段，插于灭菌好的6.1.2培养基上，一株苗 的茎段培养于同一个瓶内，诱导获得丛生芽。 7.7培养环境要求 培养室内温度保持在25℃±2℃，光照强度20001x～25001x，光照时间每天12h。 3