ICS65.020.01 CCSB05 53 云南省地方标准 DB53/T1229—2024 暗褐脉柄牛肝菌菌种生产技术规程 2024-03-01发布 2024-06-01实施 云南省市场监督管理局  发布DB53/T1229—2024 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由景洪宏臻农业科技有限公司提出。 本文件由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。 本文件起草单位：景洪宏臻农业科技有限公司。 本文件主要起草人：纪开萍、曹旸、纪光燕、王秋兰、罗顺珍、高丽霞、纪光玉、晏汐蓓、陶玲。DB53/T1229—2024 1暗褐脉柄牛肝菌菌种生产技术规程 1范围 本文件规定了暗褐脉柄牛肝菌（Phlebopusportentosus（Berk.&Broome）Boedijn）菌种的生 产条件、工艺流程、母种制备、药瓶液体菌种制备、发酵罐液体菌种制备、栽培种制备、记录与档案、 标志、包装、运输。 本文件适用于暗褐脉柄牛肝菌菌种生产。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB4806.7食品安全国家标准食品接触用塑料材料及制品 GB5749生活饮用水卫生标准 GB14881食品安全国家标准食品生产通用卫生规范 GB50073洁净厂房设计规范 NY/T528食用菌菌种生产技术规程 DB53/T491暗褐网柄牛肝菌菌种 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 暗褐脉柄牛肝菌phlebopusportentosus 又名暗褐网柄牛肝菌，拉丁文学名Phlebopusportentosus(Berk.&Broome)Boedijn，商品名 黑牛肝菌，隶属于牛肝菌目Boletales、小牛肝菌科Boletinellaceae、脉柄牛肝菌属Phlebopus。 3.2 暗褐脉柄牛肝菌菌种phlebopusportentosusspawn 暗褐脉柄牛肝菌菌丝体及其生长基质组成的液体和（或）固体繁殖材料，包括母种、摇瓶液体菌种、 发酵罐液体菌种、栽培种。 3.3 母种stockculture 经组织分离、菌种选育等方式获得的，以玻璃试管或培养皿为培养容器，培养基质为营养液添加琼 脂制成的固体培养基，具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物。 3.4 摇瓶液体菌种conicalflaskliquidspawn 由母种扩繁而得的，以摇瓶为培养容器，培养基质为营养液，具有结实性的菌丝体纯培养物。 3.5 发酵罐液体菌种fermenterliquidspawnDB53/T1229—2024 2由摇瓶液体菌种扩繁而得的，以发酵罐为培养容器，培养基质为营养液，具有结实性的菌丝体纯培 养物。 3.6 栽培种cultivatedspawn 由母种、摇瓶液体菌种或发酵罐液体菌种等扩繁而得的，以一定容量的瓶子或袋子为培养容器，培 养基质为富含木质纤维素或谷物粒等天然有机物添加营养液，具有结实性的菌丝体纯培养物。 4生产条件 4.1人员 人员应符合GB14881中的相关规定，并经专业技术培训后，掌握暗褐脉柄牛肝菌基础知识及暗褐脉 柄牛肝菌菌种生产技术规程。 4.2生产环境 生产环境应符合NY/T528中的相关要求。 4.3设施 4.3.1主要设施 主要设施包括原材料堆场、原材料库、培养基配制室、灭菌室、摇瓶接种室、摇瓶培养室、发酵罐 配料室、发酵罐冷却室、发酵罐接种室、发酵罐培养室、栽培种冷却室、栽培种接种室、栽培种培养室、 化验室等。 4.3.2设施要求 设施应符合以下要求： a)地面应能防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，有适当的排水坡度（1.0%～1.5%）和良好 的排水系统，排水沟应是圆弧式的明沟； b)墙壁和天花板应能防潮、防霉、防水、易清洗； c)门窗应设置防蚊蝇纱网； d)入口处应设置洗手、消毒和干手、风淋等洁净设施，并设置二次更衣； e)设置有排气管道； f)设置与职工人数相适应的更衣室、浴室、厕所和工作休息室； g)净化操作区域应符合GB50073中的相关要求； h)摇瓶接种室、摇瓶培养室、发酵罐配料室、发酵罐冷却室、发酵罐接种室、发酵罐培养室、 栽培种冷却室、栽培种接种室、栽培种培养室为万级无菌净化操作区域； i)开盖接种重点区域局部达到无菌级百级。 4.4设备 4.4.1生产设备 包括但不限于发电设备、调温设备、空气压缩机、空气过滤器、高压蒸汽灭菌锅、搅拌机、装瓶设 备、超净工作台、恒温回旋式振荡器、液体菌种发酵罐、接种设备等。 4.4.2检验设备DB53/T1229—2024 3恒温培养箱、冰箱、显微镜、磁力搅拌机、电子天平、pH计等。 4.5器具 4.5.1玻璃三角瓶 容量500mL～1000mL，耐126℃高温，无色或近无色，配备硅胶塞。 4.5.2聚丙烯塑料瓶 符合GB4806.7的规定，容量1400mL～1600mL，可耐受126℃，无色或近无色，瓶口直径6cm～ 9cm，瓶盖应预留通气孔，并可夹垫海绵片或无纺布以防止培养期的污染。 4.5.3其他 培养皿、接种铲/针、打孔器、试管、量杯、容量瓶、玻璃漏斗、定量定性滤纸等。 5工艺流程 工艺流程为：母种—接种摇瓶培养—摇瓶液体菌种—接种发酵罐培养—发酵罐液体菌种—接种栽培 瓶培养—栽培种。 6母种制备 6.1母种制备应符合NY/T528的规定。 6.2母种质量要求应符合DB53/T491中的规定。 6.3母种培养基配方可参照附录A。 7摇瓶液体菌种制备 7.1培养基配制与分装 培养基配参见附录A。用水符合GB5749要求，以4.5.1中的玻璃三角瓶分装培养基，装液量不超过 三角瓶容量的60%。 7.2灭菌 灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完毕后，应自然降压，不允许强制降压。 7.3冷却 将灭菌后的液体培养基放入摇瓶接种室内超净工作台中进行冷却，冷却至20℃～25℃。 7.4接种 在超净工作台上，使用打孔器和接种铲/针，按无菌操作要求接种。每瓶接2～3块，直径6mm～8mm 琼脂培养基的母种菌块。 7.5培养 7.5.1培养室准备DB53/T1229—2024 4培养室使用的前两天，宜用臭氧发生器消毒。恒温回旋式振荡器以1.8g/L～2.2g/L新洁尔灭或75% 酒精进行擦拭消毒。 7.5.2培养方法 接种后，置于恒温回旋式振荡器培养6d～7d，振荡频率150r/min～180r/min，培养温度26℃～ 29℃为宜。 7.6检查 培养期间每天检查，及时去除污染或异常的菌种，并应留样用于检验。 7.7质量要求 培养结束时，摇瓶液体菌种应达到表1中的技术指标及表2中的理化指标。 表1摇瓶液体菌种技术指标 特征 指标 菌丝形态 菌丝体球状，呈淡黄色，菌球大小均匀，形状规则，均匀悬浮分布于菌液中。 菌液形态 菌液黄至黄褐色，黏度大，澄清，静置不分层。 菌液气味 有类似于暗褐脉柄牛肝菌菇体的的芳香气味，无异味，如酸、臭味等。 菌丝显微形态有大量分枝，分枝角度小于45°，菌丝纤细，有锁状联合，无霉菌菌丝、酵母和细菌菌 体。 表2摇瓶液体菌种理化指标 性质 指标 终止pH值 3.9～4.5 菌丝干重（g/L） 2～3.5 8发酵罐液体菌种制备 8.1投料前准备 检查罐上全部阀门、安全阀、压力表，要求完好，工作正常。对罐体内、外和全部阀门用流水进行 冲洗，内壁无任何培养料残余物、清洁无死角。 8.2培养基制备 参照附录A中的培养基配方进行配制。用水应符合GB5749要求。 8.3投料定容 8.3.1将原材料分别用水溶解，倒入或用泵抽入发酵罐中。 8.3.2加水定容至所需体积，培养基投料量不超过罐体总容积的70%。 8.3.3清理加料口，不应有残留的物料，拧紧上料口盖。