ICS 65.020.30 CCS B 43 52 贵州省 地方 标准 DB52/T 1869—2025 猪体细胞培养与冷冻保存技术规程 Technical regulation of pig cell culture and cryopreservation 2025 - 03 - 06发布 2025 - 06 - 01实施 贵州省市场监督管理局 发布 DB52/T 1869 —2025 I 目次 前言 ................................ ................................ ................. II 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 缩略语 ................................ ................................ ............. 1 5 基本要求 ................................ ................................ ........... 2 6 体细胞采集 ................................ ................................ ......... 2 7 体细胞体外培养 ................................ ................................ ..... 3 8 冷冻保存 ................................ ................................ ........... 4 9 复苏和活力鉴定 ................................ ................................ ..... 4 附录A（资料性） 实验准备 ................................ ............................. 5 附录B（资料性） 试剂与要求 ................................ ........................... 6 附录C（资料性） 细胞冻存和复苏登记表 ................................ ................. 7 DB52/T 1869 —2025 II 前言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由贵州省畜牧兽医研究所提出。 本文件由贵州省农业农村厅归口。 本文件起草单位：贵州省畜牧兽医研究所，贵州省畜禽遗传资源管理站、贵州省种畜禽种质测定中 心、松桃苗族自治县农业农村局、贵州省动物疫病预防控制中心、黔西市农业农村局、道真县畜牧渔业发展服务中心、万山区畜牧技术推广站。 本文件主要起草人：谭娅、杨齐心、吴玙彤、黄智宇、李晨、熊力、齐婧、石丽娟、杨阿明、邱家 俊、裴国海、张正群、张静、卢昱希、赵春萍、杜春林、姚敏、龙清孟、李平、杨红文、申李、何润霞、姚建军。 DB52/T 1869 —2025 1 猪体细胞培养与冷冻保存技术规程 1 范围 本文件规定了基本要求 、体细胞采集、体细胞体外培养、体细胞鉴定、冷冻保存、复苏和活力鉴定 的内容与方法。 本文件适用于猪耳组织、脂肪组织、肌肉组织的体细胞 采集、体外培养、冷冻保存 及复苏和活力鉴 定方法。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 5458 液氮生物容器 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 原代细胞 primary cells 直接从动物的组织或器官，将其分散成为单个细胞后，在人工条件下培养使其存活 、生长、增殖 并 开始体外培养 的细胞。 体细胞 somatic cells 来源于受精卵，并携带生物个体全部遗传信息的一类细胞。 细胞冷冻保存 cells cryopreservation 将体外培养的细胞与细胞冻存液按一定的比例混合后，按照设定的降温程序降温，最后浸入液氮中 进行长期保存的方法。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate Buffer Saline），主要成分为磷酸盐酸二氢钠、磷酸盐氢二钠、 氯化钠，主要用来洗涤细胞 。 消化Buffer：消化缓冲液，多为浓度为 20 g/L的牛血清白蛋白，对细胞主要起到机械保护作用。 DB52/T 1869 —2025 2 IF：免疫荧光染色（ Immunofluorescence ），基于抗原 -抗体特异性反应，将荧光物质（最常用的 是荧光素）标记于抗原或抗体上，当其与相应抗体或抗原结合后，就会在荧光显微镜下呈现特异性的荧 光反应。 qPCR：实时荧光定量 PCR（Real-time Quantitative PCR ）是一种在 DNA扩增反应中，以荧光化学物 质测每次聚合酶链式反应（ PCR）循环后产物总量的方法。 5 基本要求 实验室 实验室符合 GB 19489 要求。工作区应设置准备室、缓冲间、无菌间、细胞保存室等。其中，缓冲间 面积不得小于 3 m2，应设置更衣柜和紫外灯，紫外灯强度不得低于 1.5 W/m3。紫外灯管距地面不应超过 2.5 m，每次照射时间不少于 30 min。无菌室的无菌等级最低标准应达到 C级，操作区应达到 B级，温度应 控制在20 ℃～24 ℃，湿度应控制在 45%～60%为宜。 实验准备 5.2.1 仪器设备 仪器设备见附录 A.1。 5.2.2 耗材 耗材见附录 A.2。 5.2.3 试剂与培养液 试剂、药品、培养液配置及要求见附录 B。 6 体细胞采集 供体选择 选取生长发育良好的健康猪只。 采集 6.2.1 耳组织采集 用75%酒精擦洗耳组织边缘部位，用消毒后的手术刀刮净采样部位的耳毛，再用 75%的酒精消毒后 用 剪耳钳采样。 6.2.2 脂肪组织采集 用75%酒精擦洗猪 胴体后颈部皮下脂肪部位，用消毒后的手术刀刮净皮肤上的毛发，取适量皮下组 织，立即用生理盐水冲洗干净。 6.2.3 肌肉组织采集 采集适量的猪 胴体背最长肌部位，立即用生理盐水冲洗干净。