ICS 65.020.99 CCS B 65 DB51四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 3245 —2025 大熊猫基因资源库构建技术规程 2025 - 03 - 19发布 2025 - 04 - 19实施 四川省市场监督管理局 发布DB51/T 3245 —2025 I 目 次 前言 ................................ ................................ ................ II 1 范围 ................................ ................................ .............. 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ .... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ........ 1 4 基本要求 ................................ ................................ .......... 1 5 大熊猫组织库构建技术 ................................ .............................. 2 6 大熊猫精子库构建技术 ................................ .............................. 2 7 大熊猫体细胞库构建技术 ................................ ............................ 3 附录A （资料性） 大熊猫资源保存登记表 ................................ .............. 5 附录B （资料性） 大熊猫精液与体细胞资源保存相关试剂配制 ............................ 8 DB51/T 3245 —2025 II 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由四川省林业和草原局提出、归口、解释并组织实施。 本文件起草单位：成都大熊猫繁育研究基地。 本文件主要起草人：侯蓉、刘玉良、安俊辉、王东辉、陈依娇、陈佳松、蔡志刚、王海瑞、李媛。 DB51/T 3245 —2025 1 大熊猫基因资源库构建技术规程 1 范围 本文件规定了大熊猫组织、精液及体细胞的采集与 保存技术要求。 本文件适用于大熊猫基因资源库的构建。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 5458 液氮生物容器 GB/T 40365 细胞无菌检测通则 GB/T 42398 细胞培养洁净室设计技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 基本要求 4.1 器具准备及高温灭菌 4.1.1 玻璃器皿 玻璃器皿 使用前宜 放入5%稀盐酸中浸泡 12 h，再用手工或超声波清洗器在加有洗涤剂的温热水中 进行刷拭。洗净的玻璃器皿用牛皮纸封口后进行 高压湿热灭菌（ 120 °C，20 min），干燥后待用 。 4.1.2 金属制品 使用之前进行高压湿热灭菌（ 120 °C，20 min），干燥后待用 。 4.1.3 塑料制品 枪头高压湿热灭菌（ 120 °C，20 min），干燥后待用 。 4.1.4 其他制品 毛巾及纱布清洁后进行高压湿热灭菌（ 120 °C，20 min），干燥后待用。 胶塞、吸管胶头、移液枪用 75%酒精擦拭消毒，待酒精挥发尽后使用。 4.2 细胞分离培养工作区条件 DB51/T 3245 —2025 2 细胞分离培养工作区一般由缓冲间 与无菌室组成。其中，缓冲间应设有更衣柜和紫外灯，无菌室符 合GB/T 42398 的要求，宜为万级以上的层流室，应配备超净工作台和紫外灯。紫外灯的强度为不少于 1.5 W/m3，紫外线灯管距地面不应超过 2.5 m，使用前照射 20 min～30 min。 5 大熊猫组织库构建技术 5.1 组织采集 大熊猫死亡后，尽快获取其各类组织样本，宜优先保存脏器组织（如心、肝、脾、肺、肾、卵巢、 睾丸），用镊子夹着组织在 PBS、生理盐水或无菌水中迅速漂洗样本 3次～5次，确保组织无明显的血 渍和污物。所有器械、器皿及溶液宜预先用 DEPC处理，以 避免RNA酶污染。 5.2 组织冻存 将组织用眼科剪或手术剪剪 成0.2 cm3～0.5 cm3 大小的组织块，装入 2 mL 冻存管中（管壁应标注 样本主要信息）。样本宜在 -80 °C超低温冰箱或液氮中冷冻保存 。填写大熊猫组织资源保存登记表（参 见表A.1）。 6 大熊猫精子库构建技术 6.1 精液采集 清理大熊猫直肠内的粪便，对于位置较深而难以清理的粪便，用温热生理盐水灌肠清理残余粪便。 再用接近体温 的生理盐水 冲洗大熊猫的 阴茎及包皮。 电极 棒加涂石蜡油 后插入距直肠末端约1/3处并确 保电极区抵住直肠上壁。调节 电刺激采精仪，电压 2 V～6 V，一般采用 1个～3个刺激系列，电刺激强 度由低到高，每个刺激系列之间需间隔 1 min～5 min，出现射精立刻停止刺激，将精液收集到 集精杯 中。 6.2 精液评估 6.2.1 精液采集后，对采精量、 pH值、精子密度、精子活力、精子运动状态及精子畸形率进行检测， 并填写大熊猫精液资源保存登记表（参见表 A.2）。 6.2.2 采精量：使用移液枪量取获得的精液总量 。 6.2.3 pH值：使用精密 pH试纸（测量区间为 pH=6.4～9.7）测量精液的 pH值。 6.2.4 精子密度：取 5 μL精液，添加 995 μL 3% NaCl溶液，混合均匀后取 10 μL加入血球计数 板 （25×16型），在 200×相差显微镜下计数。精子密度的计算公式为：密度 =A×107个/mL，其中： A为5 个中方格内精子总数。 6.2.5 精子活力： 取5 μL精液于载玻片上，加盖盖玻片后在 37 °C恒温装置的相差显微镜上， 可采 用目测评定法或 计算机辅助分析系统 分析法对精子活力进行评估 。每个样品至少观察三个视野（每个视 野中精子数≥ 200个）。直线前进运动的精子为 100％者评为 1.0级；90％者评定为 0.9级；如此类推。 6.2.6 精子运动状态：精子运动状态评估与活力评估的操作相同，精子向前运动的状态划分为 0级～5 级，0指不运动， 5级指快速向前运动。 6.2.7 精子畸形率： 用戊二醛固定法或巴氏染色法检测精子畸形率。 在200×相差显微镜下统计畸形精 子（包括头部畸形、颈部和中段畸形、主段畸形和过多的胞浆残余体）的比率 ，每个样品观察精子总数 ≥200个。 DB51/T 3245 —2025 3 6.3 精液冷冻 及保存 6.3.1 稀释：15 mL离心管收集精液， 稀释液采用 37 °C水浴精液冷冻液（参见附录 B），根据精液密 度计算添加冷冻液体积，最终稀释后精液密度为 4×108个/mL。 6.3.2 平衡：15 mL离心管收集 稀释后的精液 ，将离心管 置于250 mL 烧杯（盛有 200 mL～220 mL 的 37 °C水）的中部， 4 °C冰箱中隔水缓慢降温 平衡4 h。 6.3.3 装管：采用 0.25 mL冻精细管进行灌装并封口，管 壁标记谱系号及采精日期 等。 6.3.4 冷冻：采用两步法进行精液冷冻。第 1步：将细管放置在 冷冻架距离液氮面约 7.5 cm （温度 约为-110 °C）处1 min；第2步：用止血钳 将细管放置在 冷冻架距离液氮面约 2.5 cm 处1 min（温度 约为-180 °C），然后 将细管放入液氮长期保存 。 6.3.5 登记：对照大熊猫精液资源保存登记表（参见表 A.2）进行准确填写，对入库细管的数量、冷 冻日期以及存放位置进行登记。 7 大熊猫体细胞库构建技术 7.1 样本采集 按下列要求 尽快采集样本并填写大熊猫 体细胞资源保存登记表 （参见表 A.3），每只大熊猫个体至 少保存1种细胞， 宜来源于以下组织： ——脐带：大熊猫幼仔的脐带组织，长度为不小于 2 cm； ——皮肤：死亡大熊猫的皮肤组织，面积不小于 2 cm2； ——肌肉：死亡大熊猫的肌肉组织，体积不小于 2 cm3； 样本均放置于 4 °C采样液中，应及时运往实验室 。脐带的运输时间不宜 超过24 h，皮肤的运输时 间不宜超过 48 h，肌肉的运