ICS 07.080 CCS A 40 DB51 四川 省地方标准 DB51/T 3184—2024 医用供体猪 基因鉴定通则 四川省市场监督管理局 发布 2024 - 07 - 09发布 2024 - 08 - 09实施DB51/T 3184 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由四川省经济和信息化厅提出 、归口并解释 。 本文件起草单位： 中国测试技术研究院生物研究所 、成都中科奥格生物科技有限公司 、四川省医学 科学院•四川省人民医院 、四川泰康医院 、南京医科大学附 属苏州医院 、海南医学院第二附属医院 、华 中科技大学同济医学院附属同济医院 、空军军医大学第一附属医院 、成都达硕实验动物有限公司 、成都 爱迪眼科医院 、四川省机械研究设计院（集团）有限公司 、四川省实验动物学会医用猪专业委员会 。 本文件主要起草人： 周李华、潘登科、马丽侠、邢向阳、陈璐、 邓绍平、 王佳梅、 李巅远、张玉兰、 王毅、杜嘉祥、 陈刚、蒋子敬、 窦科峰、杨恒钰、钟浩、姚晓明、庄瑛、莫玲。 DB51/T 3184 —2024 1 医用供体猪 基因鉴定通则 1 范围 本文件规定了医用供体猪基因鉴定的总体原则及鉴定方法。 本文件适用于医用供体猪的生产、引种、交付过程中基因鉴定。 基因修饰动物的基因鉴定可参考本文件。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 30989 高通量基因测序技术规程 GB/T 33681.1 高通量基因测序样本预处理方法 第1部分：动物组织样本预处理 GB/T 35537 高通量基因测序结果评价要求 GB/T 38477 基因表达的测定 蛋白印迹法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 医用供体猪 medical don or pigs 通过生物工程技术获得，用于提供医疗用途的活器官或生物材料制备的低免疫原性猪及其群体。 3.2 基因修饰 genetic modification 利用生物化学方法修改生物遗传物质，使生物产生新性状，修饰方式主要包括转基因、基因编辑介 导的基因定点插入和基因敲除 3种。 注： 医用供体猪常见基因修饰 名称及种类见附录 A。 3.3 基因整合 gene integration 将特定基因片段导入宿主基因组内的基因修饰方法，包括转基因和基因定点插入。 3.4 基因敲除 gene knock out 将特定基因片段从基因组中去除的基因修饰方式。 3.5 遗传稳定性 genetic stability 通过连续检测不同代数基因修饰动物基因型、 基因表达情况来评估基因修饰在动物群体中遗传稳定 及表达稳定的手段。 3.6 基因组结构变异 genome structural variants DB51/T 3184 —2024 2 在医用供体猪获得过程中，基因组上发生长片段 （ >50 bp）的序列变化和位置关系变化。 注： 基因组结构变异包括长片段序列插入或删除、串联重复、染色体倒位、染色体内部或染色体之间的序列易位、 基因拷贝数变异以及嵌合性变异等。 3.7 脱靶 off-target 与靶标不同的基因组位置和 /或核酸序列。 示例：结合脱靶、切割脱靶、编辑脱靶、序列改变脱靶。 注： 编辑脱靶属于非预期编辑。 [来源：ISO 5058:1 -2021，3.1.4] 3.8 高通量测序 high-throughput sequencing 以一次并行几十万到几百万条核酸分子序列测定和一般读长较短等为标志， 适用于 DNA的测序技术。 [来源：GB/T 35890-2018，3.1] 4 总体原则 基因鉴定是医用供体猪制备过程中重要组成环节，医用供体猪制备、筛选、交付等过程应对其进行 基因鉴定。因其用途的特殊性，医用供体猪基因鉴定应同时考虑安全性和有效性，降低因基因修饰技术 引入的不可控因素。安全性和有效性评价应结合设计预期、基因修饰类型进行综合评估，鉴定项目可参 考表1。 表1 医用供体猪基因鉴定评价项目 序号 鉴定/检测项目 评价类型 1 基因型 有效性评价 2 基因表达 3 遗传稳定性 遗传稳定检测 4 基因组结构变异 安全性评价 5 脱靶 5 鉴定项目及方法 有效性评价 5.1 5.1.1 基因型鉴定 5.1.1.1 鉴定方法 样本 DNA提取可选用符合要求的 市售试剂盒进行提取，也可由实验室 自配试剂进行 提取。引物设 计应在目标基因 （拟整合基因 /敲除基因靶位） 上下游设计引物。 样本 DNA提取后， 符合质量要求的 DNA 进行 PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，观察目标条带判定是否符合预期。判定基因整合见 5.1.1.2 a）。 判定目标基因的是否敲除，应将符合预期的条带回收，进行测序（见 5.1.1.2 b））。 注： 基因整合鉴定示例见附录 B，基因敲除鉴定示例见附录 C。 5.1.1.2 结果判定 DB51/T 3184 —2024 3 a) 出现目标条带，则判定基因整合有效。 b) 目标片段测序结果和参考序列比对，靶位产生不为 3的倍数碱基的插入和缺失 ,则判定基因敲 除有效。 5.1.2 基因表达 5.1.2.1 检测方法 选取与目标蛋白相结合的特异抗体对医用供体猪组织、细胞水平进行蛋白检测。可采用蛋白免疫印 迹法、免疫组化 /免疫荧光、酶联免疫吸附技术、流式细胞术等方法进行检测。建议根据不同生产工艺 选择合适的检测方法，蛋白免疫印迹法可作为基础方法选用，蛋白免疫印迹法检测及判定方法可参考 GB/T 38477 。蛋白免疫印迹、免疫组化（荧光）、酶联免疫吸附技术检测示例见附录 B。流式细胞术技 术检测示例见附录 C。 5.1.2.2 蛋白免疫印迹法 结果判定 a) 成像图片本底干净，能观察到转印膜均匀的轻微背景轮廓，目标条带清晰且不过曝，即可判 定目标蛋白表达。 b) 基因整合类应有目标基因蛋白表达，敲除类应无目标基因蛋白表达。 遗传稳定性检测 5.2 5.2.1 通用要求 医用供体猪自然繁育进行扩大化培养时应符合封闭群或近交系的育种方式， 同时应检测基因遗传稳 定性。 5.2.2 检测方法 医用供体猪群体每代个体均应进行基因型鉴定和基因表达检测，方法见 5.1，应连续监测 3代以上。 5.2.3 结果分析 医用供体猪基因型鉴定及基因表达检测结果符合基因分离定律和自由组合定律， 则认为具有遗传稳 定性。 安全性评价 5.3 5.3.1 染色体结构变异和脱靶检测 在基因修饰过程中，存在染色体结构变异和基因修饰脱靶的风险，应对原代个体进行染色体结构变 异和脱靶检测，评价安全性。 采集医用供体猪基因修饰前后的血液或组织进行高通量测序，获取医用供体猪基因组序列信息，进 行生物信息学分析。样本处理参照 GB/T 33681.1 的要求执行，测序方法参照 GB/T 30989 进行，测序质量 控制参照 GB/T 35537 执行。 5.3.2 结果分析 5.3.2.1 染色体结构变异 基因修饰前后，除基因修饰位点外，染色体其他区域基因序列无差异，医用供体猪基因组未发生非 预期基因片段插入、序列缺失、倒置、异位，则认为在医用供体猪制备过程中未引入基因安全风险。 DB51/T 3184 —2024 4 5.3.2.2 脱靶检测 使用 Cas-OFFinder （CRISPR RGEN Tools (rgenome.net) ）或类似算法模型工具，在猪基因组参考序 列内匹配脱靶风险位点，允许 sgRNA的靶标序列存在 1个～ 4个错配，医用供体猪脱靶各风险位点序列信 息和基因组参考序列一致，则认为没有脱靶，反之则存在脱靶风险。 DB51/T 3184 —2024 5 A A 附录 A （资料性） 医用供体猪常见基因名及修饰类型 医用供体猪常见基因名及修饰类型 见表A.1。 表A.1 医用供体猪常见基因名及修饰类型 基因敲除 GGTA1 B4GALNT2/B4GALNT2L CMAH PERV SLA class I or B2M 基因整合 human membrane cofactor protein transgenic (hCD46 -tg) human decay -accelerating factor transgenic (hCD55 -tg) human membrane inhibitor of reactive lysis transgenic (hCD59 -tg) human complement -regulatory protein C1 inhibitor transgenic (hC1 -INH-tg)