ICS65.150 CCSB52 DB50 重庆市地方标准 DB50/T1607—2024 水生动物细菌性病原菌耐药检测技术规范 2024-07-08发布 2024-10-08实施 重庆市市场监督管理局  发布DB50/T1607—2024 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由重庆市水产技术推广总站提出。 本文件由重庆市农业农村委员会归口并组织实施。 本文件起草单位：重庆市水产技术推广总站、中国水产科学研究院长江水产研究所、西南大学、重 庆市水产学会。 本文件主要起草人：张利平、王波、陈波、李虹、梅会清、翟旭亮、廖雨华、周勇、朱成科、卓东 渡、冯俊、薛明洋、薛洋、徐凤、甘婷婷、吴晓清、周春龙、刘晓莉、何忠谊。DB50/T1607—2024 1水生动物细菌性病原菌耐药检测技术规范 1范围 本文件规定了水生动物细菌性病原菌耐药检测的试剂、仪器设备、药敏实验、结果判定、无害化处 理和病原微实验室生物安全等技术要求。 本文件适用于水生动物细菌性病原耐药检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SC/T7015病死水生动物及病害水生动物产品无害化处理规范 SC/T7028水产养殖动物细菌耐药性调查规范通则 SC/T7201.1鱼类细菌性病检疫技术规程第1部分：通用技术 WS233病原微生物实验室生物安全通用准则 WS/T639抗菌药物敏感性试验的技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 最低抑菌浓度Minimalinhibitoryconcentration；MIC 在药物敏感性检测实验中能抑制肉眼可见微生物生长的最低抗菌药物浓度。 敏感Susceptible；S 当抗菌药物对分离株的MIC处于敏感范围时，使用推荐剂量进行治疗，该药在感染部位通常达到的 浓度可抑制被测菌的生长，临床治疗可能有效。 耐药Resistant；R 当抗菌药物对分离株的MIC处于该分类范围时，该药物浓度不能抑制细菌的生长，和（或）被测菌 株获得特殊耐药机制，临床治疗效果不佳。 4试剂 实验 实验用水、NaCl、脑心浸液肉汤、脑心浸液琼脂培养基。试剂配制应符合附录A的规定。实验用水 应符合GB/T6682中一级水的规定。DB50/T1607-2024 2 耗材 96孔药敏板、“V”型加样槽(30o～45o)。 5仪器设备 超净工作台、生物安全柜、医用冰箱、高压灭菌锅、生化培养箱、麦氏浊度仪、移液器。 6药敏试验 单菌落制备 6.1.1将已鉴定的病原菌在脑心浸液琼脂平板（或者选用已知的适宜培养基）上进行平板划线，28℃ ±2℃培养16h～24h。 6.1.2待测菌株应为单菌落。单菌落的制备可参考SC/T7201.1中分离和纯培养方法进行。 菌悬液制备 无菌棉签挑取单个菌落于5mL无菌生理盐水的比浊管中混匀，麦氏浊度仪测量，使其达到0.5麦氏 单位浓度的菌悬液，标记为A管。菌悬液应在15min内使用。 96孔药敏板加样 6.3.1取1支10mL的无菌脑心浸液肉汤，以无菌操作方式向空白对照孔中分别加入100μL无菌脑 心浸液肉汤。 6.3.2另取一支10mL的无菌脑心浸液肉汤，从A管中吸取200μL菌悬液加入到其中，记为B管。 6.3.3将B管中菌液混匀后倒入无菌“V”型槽内。 6.3.4利用移液器吸取“V”型槽内的菌液，加入到所有微孔中（空白对照除外），每孔100μL。空 白对照孔最后加入100μL无菌生理盐水。96孔药敏板所用药物及药物浓度见附录B。 6.3.5将加样后的96孔药敏板放置于28℃±2℃生化培养箱中培养24h～48h后读取结果。 结果读取 若阴性对照孔底浑浊，或阳性对照孔澄明，则此次试验无效，重新进行实验。若阴性对照孔底澄明， 阳性对照孔浑浊，则与阳性对照孔比较，孔底内液体浑浊则为阳性（+）；孔底内液体澄明，则为阴性 （-）。微孔内抑制肉眼可见微生物生长的最低抗菌药物浓度为MIC。当出现单一跳孔时，应记录抑制 细菌生长的最高药物浓度。 结果读取参考附录C96孔药敏板结果参考图。 质量控制 标准菌株宜为大肠埃希菌（ATCC25922）。标准菌株药敏实验同步骤6.1～6.4规定方法进行。 7结果判定 对照受试菌的MIC，依据SC/T7028中规定要求，将菌株判定为敏感（S）、中介（I）或耐药（R）。DB50/T1607—2024 38无害化处理 实验过程中所用的器皿、耗材及产物均需要经过121℃，15min高压灭菌后，方可处置。 9生物安全防护 实验人员必须穿着合适的实验服、佩戴好口罩、帽子及一次性手套。进行活体处理或接触含有微生 物的物品后，要洗手。离开实验室前要脱掉手套，一次性手套不得清洗和再次使用。如果发生污染性物 质溢出等事故，应及时向实验室负责人报告，并记录经过和处理方案。 禁止在实验室饮食、吸烟、化妆和储存食物。非工作人员禁止进入实验室。DB50/T1607-2024 4附录A （规范性） 试剂配制 A.1灭菌生理盐水 A.1.1配方 NaCl 8.5g 水 1000mL A.1.2配制 混匀，121℃高压灭菌15min，备用。 A.2脑心浸液（BHI）肉汤 A.2.1配方 脑心浸液肉汤培养基50.0g 水 1000mL A.2.2配制 混匀，加热使之完全溶解，用1mol/L的NaOH或HCl调节pH,使灭菌后为7.2～7.4。分装烧瓶，121℃， 高压灭菌15min。4℃保存备用。 A.3脑心浸液（BHI）琼脂平板 A.3.1配方 脑浸液琼脂培养基24.5g 水 1000mL A.3.2配制 混匀，加热使之完全溶解，用1mol/L的NaOH或HCl调节pH,使灭菌后为7.2～7.4。分装烧瓶，121℃， 高压灭菌15min，冷却至50℃左右，制成平板。4℃保存备用。