ICS65.150 CCSB52 DB50 重庆市地方标准 DB50/T1606—2024 水生动物细菌性病原鉴定技术规范 2024-07-08发布 2024-10-08实施 重庆市市场监督管理局 发布I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由重庆市水产技术推广总站提出。 本文件由重庆市农业农村委员会归口并组织实施。 本文件起草单位：重庆市水产技术推广总站、中国水产科学研究院长江水产研究所、西南大学、重 庆市水产学会。 本文件主要起草人：张利平、王波、李虹、梅会清、翟旭亮、周勇、廖雨华、陈洁、马龙强、冯俊、 薛明洋、薛洋、吴晓清、周春龙、何忠谊、徐凤、甘婷婷、陈波、刘晓莉、梅建西。1水生动物细菌性病原鉴定技术规范 1范围 本文件规定了水生动物细菌性病原鉴定的试剂、仪器设备、鉴定方法和无害化处理等技术要求。 本文件适用于水生动物细菌性病原鉴定和相关疫病诊断。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SC/T7015病死水生动物及病害水生动物产品无害化处理规范 SC/T7201.1鱼类细菌性病检疫技术规程第1部分：通用技术 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosideTriphosphate） TAE：三羟甲基氨基甲烷醋酸盐（Tris(hydroxymethyl)aminomethaneAcetateSalt） EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid） BHI：脑心浸出液肉汤（BrainHeartInfusionBroth） BHIA：脑心浸出液琼脂（BrainHeartInfusionAgar） DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethypyrocarbonate） 5试剂 实验用水、TaqDNA聚合酶、dNTP、琼脂糖、10×PCR缓冲液（含Mg2+，25mmol/L）、核酸染料、 BHI、BHIA。试剂配制见附录A。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规定。 6仪器设备 超净工作台、生物安全柜、医用冰箱、高速离心机（100rpm～20000rpm）、高压灭菌锅、PCR仪、 电泳仪、凝胶成像仪、生化培养箱、移液器等。DB50/T1606—2024 27鉴定方法 样品的制备 7.1.1同一采样点每尾（只）动物个体视为一个样本，同一采样点同一次采集的相似临床症状的样本 不超过5个。优先采集有代表性的样本，即采集具有明显临床症状的发病动物或者离群、独游、濒死的 动物。 7.1.2用75%酒精对待检测水生动物的表面进行擦拭消毒。 7.1.3放置于已消毒解剖盘中，观察样品临床症状，若有，则用灭菌接种环或剪刀挑取部分病灶组织； 若无病变，用灭菌剪刀和镊子，分别取肝、脾、肾等组织。 平板划线分离及纯化 7.2.1在超净工作台或生物安全柜中，用灭菌接种环蘸取病灶部位或其它组织在BHIA平板（或选择性 培养基或血平板）上进行三区划线，做好编号标记。 7.2.2将划线好的平板倒置在培养箱中，28℃±2℃培养16h～24h。 7.2.3观察菌落生长情况，挑取优势单菌落（参见附录B图B.1），在超净工作台或生物安全柜中用 无菌接种环挑取单菌落到装有无菌BHI增菌液（或已知的适宜培养基）的离心管中（一个单菌落对应 一个离心管），做好编号标记。挑取的不是单菌落，可稀释后重复划线纯化。 7.2.4将挑取的单菌落放置在培养箱中，28℃±2℃培养16h～24h，观察菌液状态，若浑浊，则 于4℃保存待检。 核酸模板制备 7.3.1吸取300μL的单菌落增菌液于无菌离心管中，12000rpm/min离心2min，弃上清。 7.3.2加入300μL的双蒸水，洗脱，12000rpm/min离心2min；重复一次，弃上清。 7.3.3离心管中加入300μL的双蒸水，100℃金属浴（或水浴）10min，取出后马上放入冰中冷却， 等冷却后4℃、12000r离心10min，吸取上清液作为核酸模板，放至无菌的离心管中冷藏备用；也 可使用同等抽提效果的商品化试剂盒或其它方法抽提DNA。 PCR检测 7.4.116SrDNA的通用引物 上游引物27-F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物1492-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。 7.4.2反应体系 表1PCR反应体系 反应试剂 加样体积 10×PCR缓冲液（含Mg2+） 5μL dNTP 1μL 上游引物 1μL 下游引物 1μL TaqDNA聚合酶 0.5μL 模板 2.5μLDB50/T1606—2024 3表1PCR反应体系（续） 反应试剂 加样体积 双蒸水或DEPC水 39μL 总体积 50μL 7.4.3反应条件 94℃预变性3min，94℃30s；55℃30s；72℃70s；扩增32个循环；72℃10min，最 后4℃保温。 7.4.4琼脂糖电泳 用1×TAE电泳缓冲液配置1.5%的琼脂糖凝胶。将5μL样品和1μL6×上样缓冲液混匀后加入样品 孔，在电泳时设立核酸标准分子量作对照。5V/cm电泳约0.5h，当溴酚蓝快到达琼脂糖凝胶底部时， 停止电泳。将琼脂糖凝胶浸入核酸染料中进行泡染15min，于TAE缓冲液中脱色15min，将凝胶置于凝 胶成像仪上观察。 结果判定：阳性对照16SrDNA的扩增产物在1500bp处出现特异性条带，DNA分子量标准条清楚，阴 性对照和空白对照无特异性条带，待测样品出现1500bp的特异性核酸条带，则可进行基因测序（待测 样品出现1500bp的特异性核酸条带参见附录B图B.2），否则无效。 7.4.5基因测序 取PCR产物进行基因序列测定，将测序结果与基因Bank中参考序列进行同源性比对。 7.4.6细菌种属结果的确定 基因Bank进行同源性比对，根据比对结果判定细菌种属。 8无害化处理 实验过程中所用的器皿、耗材、及产物均需要经过121℃，15min高压灭菌后，方可处置。 实验后水生动物及其组织无害化处理按照SC/T7015规定执行。 9生物安全防护 实验人员必须穿着合适的实验服、佩戴好口罩、帽子及一次性手套。进行活体处理或接触含有微生 物的物品后，要洗手。离开实验室前要脱掉手套，一次性手套不得清洗和再次使用。如果发生污染性物 质溢出等事故，应及时向实验室负责人报告，并记录经过和处理方案。 禁止在实验室饮食、吸烟、化妆、储存食物。非工作人员禁止进入实验室。DB50/T1606—2024 4附录A （规范性） 试剂配制 A.150×TAE电泳缓冲液 2mol/LTris碱 242g 1mol/L冰乙酸 57.1mL 100mmol/LEDTA 200ml的0.5mol/LEDTA（pH8.0） 加水定容至1000mL，室温贮存。 A.21×TAE电泳缓冲液 加入50×电泳缓冲液20mL并加水定容至1000mL，配置成工作液，室温贮存。 A.36×上样缓冲液 蔗糖 40g 溴酚蓝 0.25g 加水溶解，定容至100mL。