ICS 65.020．99 CCS B16 46 海 南 省 地 方 标 准 DB 46/T 644—2024 咖啡果小蠹分子鉴定技术规程 Technical code for molecular identification of coffee berry borer 2024 - 09 - 23 发布 2024 - 11 - 01 实施 海南省市场监督管理局 发 布 DB 46/T 644—2024 I 目 次 前言 ................................................................................ III 引言 ................................................................................. IV 1 范围 ................................................................................ 1 2 规范性引用文件 ...................................................................... 1 3 术语与定义 .......................................................................... 1 4 缩略语 .............................................................................. 1 5 咖啡果小蠹基本信息 .................................................................. 1 6 原理 ................................................................................ 1 7 主要仪器设备和主要试剂 .............................................................. 1 主要仪器设备 .................................................................... 1 试剂 ............................................................................ 2 8 分子鉴定操作步骤 .................................................................... 2 样品处理 ........................................................................ 2 DNA 提取 ......................................................................... 2 DNA 纯度和浓度测定 ............................................................... 2 特异性引物使用 .................................................................. 2 PCR 扩增反应 ..................................................................... 2 电泳及测序 ...................................................................... 2 9 结果判定 ............................................................................ 2 10 样品保存、复核与记录 ............................................................... 2 样品保存 ....................................................................... 2 复核 ........................................................................... 2 记录 ........................................................................... 2 附录 A （资料性） 咖啡果小蠹基本信息 ................................................... 3 A.1 生物学特性 ...................................................................... 3 A.2 传播途径 ........................................................................ 3 A.3 地理分布 ........................................................................ 3 A.4 寄主 ............................................................................ 4 附录 B （规范性） DNA提取方法及 PCR 检测方法 ........................................... 5 B.1 DNA 提取方法 ..................................................................... 5 B.2 引物序列 ........................................................................ 5 B.3 扩增反应体系 .................................................................... 5 B.4 扩增反应条件 .................................................................... 5 DB 46/T 644—2024 II B.5 PCR 扩增片段电泳结果 ............................................................. 5 B.6 PCR 扩增片段测序结果 ............................................................. 6 B.7 结果判定 ......................................................................... 6 DB 46/T 644—2024 III 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的 规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由海南省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：中国热带农业科学院香料饮料研究所。 本文件主要起草人：孟倩倩、王政、孙世伟、高圣风、苟亚峰、刘世超、田甜、温思为、薛超。DB 46/T 644—2024 IV 引 言 2019 年 5 月，首次在海南省万宁市兴隆地区咖啡种植园中发现咖啡果小蠹入侵，标本经鉴定确定 为咖啡果小蠹，于 2019 年 6 月上报农业农村部。海南地区作为罗布斯塔咖啡主要产区，目前在海南 万宁、琼中、琼海等地均发现咖啡果小蠹为害。 依据外部形态学特征对咖啡果小蠹的鉴定，需要昆虫分类专业人员和显微设备才能鉴别，特别是对 于卵、幼虫、蛹及特征脱落的残体等样本，存在鉴别难度大、耗时长等问题。 鉴于以上原因，特制定本文件，可显著提高咖啡果小蠹检测效率，为咖啡果小蠹的口岸检疫、监测 防控提供必要的技术支撑。 DB 46/T 644—2024 1 咖啡果小蠹分子鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了咖啡果小蠹的缩略语、 基本信息、 原理、 仪器和试剂、 分子鉴定操作步骤、 结果判定、 样品保存、复核与记录。 本文件适用于植物及其产品中携带咖啡果小蠹的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语与定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA