ICS 65.020 CCS B30 43 湖南省地方 标准 DB 43/T 3133—2024 水稻核辐射靶向基因突变筛选技术规程 Code for targeted mutation gene screening techniques on rice by nuclear -radiation 2024 - 12 - 31发布 2025 - 03 - 31实施 湖南省市场监督管理局 发布 DB 43/T 3133— 2024 I 目次 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 原理 ............................................................................... 1 5 核辐射诱变源及材料 ................................................................. 2 6 仪器设备及试剂盒 ................................................................... 2 7 操作步骤 ........................................................................... 2 8 植株材料编号 ....................................................................... 3 9 突变体档案 ......................................................................... 3 附录A（资料性） 文库构建与突变体筛选的反应体系和程序 ................................. 4 DB 43/T 3133— 2024 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由湖南省农业农村厅提出。 本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：湖南省核农学与航天育种研究所、华智生物技术有限公司。 本文件主要起草人：杨震、张莉、张逸妍、吕思维、张渊海、李文革、张勇、彭妙、彭选明、 唐顺 学、吴云天、陈哲红。DB 43/T 3133— 2024 1 水稻核辐射靶向基因突变筛选技术规程 1 范围 本文件规定了水稻核辐射靶向基因突变筛选技术的原理、诱变源及材料、仪器设备以及操作步骤等 内容。 本文件适用于采用核辐射诱变水稻种子获得靶向基因突变体。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 4404.1 粮食作物种子 第1部分：禾谷类 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 核辐射 atom radiation 原子核从一种结构或一种能量状态转变为另一种结构或另一种能量状态过程中所释放出来的微观 粒子流。核辐射一般分为粒子辐射和电磁辐射两大类，包括α粒子、β粒子、γ射线、 X射线、中子、 质子、电子、离子束等。 最适辐射剂量 optimal radiation dosage 辐射当代幼苗期，苗高较对照降低 50%时的辐射剂量 。 诱变群体 mutant population 指通过物理或化学诱变剂处理，人为诱导基因突变所获得的生物群体。 靶向筛选 targeted screening 根据靶向基因序列设计分子探针，与基 因组文库杂交捕获，对捕获片段 PCR扩增，测序获得靶向基 因的突变位点信息。 4 原理 采用物理诱变源辐射水稻干种子，将 M2代群体制备成多个 DNA混池，分别构建 DNA文库；根据靶 向基因序列设计分子探针，将探针与 DNA文库进行杂交；采用磁珠富集杂交后的产物，构建富集文库； 对富集文库进行鉴定分析，筛选出与靶向基因序列有差异的 DNA混池；对混池内各单株进行靶向基因测 序，获得靶向基因突变单株。 DB 43/T 3133— 2024 2 5 核辐射诱变源及材料 诱变源 可采用α粒子、β粒子、γ射线、中子、质子、电子、离子束等物理诱变源。 主要材料 水稻干种子，质量应符合 GB/T 4404.1。 6 仪器设备及试剂盒 仪器设备 主要包括组织研磨仪、高速冷冻离心机、核酸浓度测定仪、水浴锅、 PCR扩增仪、琼脂糖凝胶电泳 仪、水平电泳槽及制胶附件、凝胶成像系统、 MiniSeq 500 测序仪、 Serapure 磁珠。 试剂盒 主要包括 DNA提取试剂盒、文库构建试剂盒、扩增试剂盒、杂交试剂盒、测序试剂盒等。 7 操作步骤 诱变材料的选择 选择综合性状优良、遗传稳定性好的纯系自交品种，针对育种目标性状进行靶向基因突变的筛选。 最适辐射剂量 γ射线300 Gy～350 Gy，12C+6离子束120 Gy～150 Gy，电子束是 300 Gy～350 Gy，中子 12 Gy～ 20 Gy、质子150 Gy～200 Gy。 辐射诱变材料群体的获取与靶向变异筛选 7.3.1 获取诱变群体 M1代多本粗插，混收获得 M2代种子。 M2代进行大田单本移栽或实验室水培。 7.3.2 制备DNA混池 苗期M2群体以100个单株作为一组，每单株随机取一个叶片，每叶片采用直径为 5 mm～7 mm的 打孔器取叶片进行混合，制备 DNA混池。采用植物基因组提取试剂盒进行 DNA提取。 7.3.3 设计分子探针 在水稻基因组数据库中查找靶向基因 DNA序列，利用引物设计软件设计覆盖该基因所有外显子、 80 bp～130 bp长度的分子探针。 7.3.4 构建DNA文库 将各混池 DNA进行片段化处理，加上 A尾，连接测序接头并纯化，扩增得到 DNA文库。反应体系见 附录A.1-A.3。