ICS 65.020.30 CCS B 41 DB42 湖北省 地方 标准 DB42/T 2252—2024 牛无绿藻 PCR-RFLP检测技术 PCR-RFLP detection technique for Prototheca bovis 2024 - 07 - 29发布 2024 - 09 - 29实施 湖北省市场监督管理局 发布 DB42/T 2252 —2024 I 目次 前言 ................................ ................................ ................ III 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 缩略语 ................................ ................................ ............. 1 5 实验原理 ................................ ................................ ........... 2 6 仪器设备 ................................ ................................ ........... 2 7 试剂和材料 ................................ ................................ ......... 2 8 样品的制备 ................................ ................................ ......... 3 9 检测步骤 ................................ ................................ ........... 4 10 结果判定 ................................ ................................ .......... 5 11 实验室生物安全要求 ................................ ................................ 6 12 标准实施及评价 ................................ ................................ .... 6 附录A（资料性） 湖北省地方标准实施信息及意见反馈表 ................................ ... 8 DB42/T 2252 —2024 III 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 武汉市农业科学院提出 。 本文件由 湖北省农业农村厅 归口。 本文件起草单位： 武汉市农业科学院、华中农业大学。 本文件主要起草人： 陈夏冰、陈洁、胡长敏、丁一、邵志勇、吴利军、丁明星、万平民、何斌、金 尔光、杨文海、童伟文、王肆玖、周源。 本文件实施应用中的疑问， 可咨询 湖北省农业农村厅 ， 电话：027-87665821 ， 邮箱：[email protected] ； 或者牵头起草单位 武汉市农业科学院 ，联系电话： 027-81776359 ，邮箱：[email protected] 。 对本文件的有关修改意见建议请 反馈至武汉市农业科学院 ，联系电话：027-81776359 ，邮箱： [email protected] 。 DB42/T 2252 —2024 1 牛无绿藻 PCR-RFLP检测技术 1 范围 本文件规定了牛无绿藻 PCR-RFLP检测技术所涉及的实验原理、 仪器设备、 试剂和材料、 样品 的制备、 检测步骤、结果判定等技术标准。 本文件适用于生鲜乳中牛无绿藻的定性检测、实验室诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 4789.2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 GB/T 6682 分析实验室用水 规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 SN/T 3902 检验检疫二级生物安全实验室通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 牛无绿藻 Prototheca bovis 一种真核生物，绿藻纲，绿藻门，共球藻纲，小球藻目，小球藻科，无绿藻属，能够引起奶牛乳腺 炎。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 P.bovis：牛无绿藻（ Prototheca bovis ） DNA：脱氧核糖核酸（ DeoxyriboNucleic Acid ） PIM：无绿藻分离培养基（ Prototheca Isolation Medium） TSB：胰蛋白胨大豆肉汤培养基（ Tryptone Soybean Broth Medium ） PCR：聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ） PCR-RFLP：限制性片段长度多态性聚合酶链反应（ Restriction Fragment Length Polymorphism PCR） PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate Buffer Saline ） TAE：三乙醇胺四乙酸缓冲液（ Tris-acatate-ethylene Diamine Tetraacetic Acid Buffer ） DB42/T 2252 —2024 2 cytb：细胞色素 b（cytochrome b ） 5 实验原理 cytb基因在牛无绿藻中相对保守，通过对 牛无绿藻cytb基因序列的进行分析，设计了特异性 PCR引 物，可扩增牛无绿藻，然后通过特异性的限制性酶切反应，鉴定牛无绿藻 。 6 仪器设备 仪器设备包括但不限于： a) 超净工作台； b) 高速冷冻离心机； c) 恒温震荡培养箱； d) 冰箱； e) PCR仪； f) 凝胶成像仪； g) 电泳仪； h) 水浴锅； i) 单道微量移液器（ 0.5 µL～10 µL、10 µL～50 µL、20 µL～200 µL、100 µL～1000 µL等规格） 。 7 试剂和材料 试剂 7.1.1 培养基和样品制备： PIM配制见表1、TSB配制见表2。PIM配制按表1中成分溶解于蒸馏水中， pH 5.1 ± 0.1，121 ℃高压灭菌 15 min。TSB配制按表2中成分溶解于蒸馏水中， pH 7.3 ± 0.2，121 ℃高 压灭菌15 min。 表1 PIM配制表 成分 g/L 邻苯二甲酸氢钾 10.0 氢氧化钠 0.9 硫酸镁 0.1 磷酸二氢钾 0.2 氯化铵 0.3 葡萄糖 10.0 盐酸硫胺素 0.001 琼脂 20.0 5-氟胞嘧啶 0.25