ICS 65.020.01 CCS B 05 DB42 湖北省 地方 标准 DB42/T 2215—2024 甘蓝型油菜品种真实性及其实质性派生品 种 MNP鉴定法 Rapeseed varieties authenticity and essential derived varieties — MNP test method 2024 - 03 - 26发布 2024 - 05 - 26实施 湖北省市场监督管理局 发布 DB42/T 2215 —2024 I 目次 前言 ................................ ................................ ................ III 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 原理 ................................ ................................ ............... 1 5 试剂或材料 ................................ ................................ ......... 2 6 主要仪器设备 ................................ ................................ ....... 2 7 测定步骤 ................................ ................................ ........... 2 8 结果分析与判定 ................................ ................................ ..... 3 附录A（资料性） 油菜MNP标记和标记检测引物 ................................ ........... 5 DB42/T 2215 —2024 III 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国农业科学院油料作物研究所提出。 本文件由湖北省农业农村厅归口。 本文件起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、江汉大学。 本文件起草人：刘佳、胡琼、彭海、李甜甜、梅德圣、汪文祥、成洪涛、李超、王会。 本文件实施应用中的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话： 027-87665821 ，邮箱： [email protected] ， 有关修改意见建议请反馈至中国农业科学院油料作物研究所， 联系电话： 13720301092 ， 邮箱：[email protected] 。 DB42/T 2215 —2024 1 甘蓝型油菜品种真实性及其实质性派生品种 MNP鉴定法 1 范围 本文件规定了油菜品种鉴定多核苷酸多态性（ multiple nucleotide polymorphism, MNP）标记法 的原理、试剂或材料、仪器设备、测定步骤、结果分析方法及评价标准。 本文件适用于甘蓝型油菜（ Brassica napus L.）的品种真实性 鉴定和实质性派生品种鉴定 。其他芸 薹属（ Brassica）植物品种（系）可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 38551 植物品种鉴定 MNP标记法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 多核苷酸多态性 multiple nucleotide polymorphism (MNP) 在基因组水平上由多个核苷酸引起的序列多态性。 实质性派生品种 essential derived variety (EDV) 由原始品种派生或者由原始品种的实质性派生品种再次派生，且保留了原始品种的基本性状；与原 始品种存在明显区别；受原始品种的基因型或基因型组合控制的 基本性状的表达与原始品种相同。 平均覆盖倍数 average coverage 在基因组上比对到所有标记位点上的所有测序片段的总数与标记位点总数的比值。 检出的标记位点 detected markers 至少有一个等位基因型且有 20条及以上测序片段支持的标记位点。 4 原理 利用多重聚合酶链式反应扩增 (PCR)和二代高通量测序，获得样品基因组上的 MNP标记位点的多态 性，判定标记位点的分型结果并依此作出鉴定结论 。 DB42/T 2215 —2024 2 5 试剂或材料 水：GB/T 6682 一级。 DNA提取试剂盒 。 多重PCR扩增与文库构建试剂盒。 高通量测序试剂盒。 MNP标记引物：见附录 A。 6 主要仪器设备 PCR仪。 高通量测序仪。 核酸定量仪。 移液器。 7 测定步骤 操作要求 样品准备、 DNA提取、多重 PCR扩增与文库构建、高通量测序各自在规定的 实验室按单一方向进行操 作，且保持实验室通风良好，严防气溶胶污染。不同区域的仪器设备应专用。 取样方法 7.2.1 从植物品种群体中的抽样应具代表性，抽取至少 20个个体样本混合物。农作物种子扦样应符合 GB/T 3543.2 要求。 7.2.2 样品中个体的类型宜为新鲜且幼嫩的叶、根、茎、胚等器官或组织。 DNA提取 样品提取与纯化的 DNA溶液应在 260 nm与230 nm处的吸光度比值大于 2.0；在260 nm与280 nm处的吸光 度比值介于 1.7～1.9；DNA电泳主带明显，无明显降解拖带和 RNA残留。 多重PCR扩增与文库构建 按多重PCR扩增与文库构建试剂盒的说明书进行 DNA质控、多重 PCR扩增、文库构建与纯化。且规定 多重PCR的扩增循环数不高于 20个。 高通量测序 按高通量测序试剂盒和高通量测序仪的操作说明进行高通量测序。 高通量测序的平均覆盖倍数设置为 700倍以上，测序拼接后完整长度大于标记引物在参考基因组上 的扩增长度。 测序数据质量控制 数据质量控制如下：