ICS 65.020.30 CCS B 41 41 河南省 地方 标准 DB41/T 2595—2024 猪急性腹泻综合征诊断技术 2024-02-01发布 2024-05-01实施 河南省市场监督管理局 发布 DB41/T 2595 —2024 I 目次 前言 ................................ ................................ ................. II 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 缩略语 ................................ ................................ ............. 1 5 临床诊断 ................................ ................................ ........... 1 6 样品采集及处理 ................................ ................................ ..... 2 7 病原分离与鉴定 ................................ ................................ ..... 3 8 RT-PCR检测方法 ................................ ................................ ..... 3 9 荧光PCR检测方法 ................................ ................................ ... 5 10 综合判定 ................................ ................................ .......... 7 附录A（规范性） 核酸提取及聚 PCR反应溶液的配制 ................................ ....... 8 附录B（资料性） SADS-CoV RT-PCR产物电泳图及荧光 PCR扩增曲线图 ...................... 10 DB41/T 2595 —2024 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件的某些内容可能 涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由河南省农业农村厅提出 并归口。 本文件起草单位： 河南省动物疫病预防控制中心、襄城县动物疫病预防控制中心、南阳市卧龙区动 物疫病预防控制中心 、修武县云台山镇综合行政执法大队 。 本文件主要起草人： 班付国、闫若潜、王淑娟、赵雪丽、谢彩华、马震原、王东方、杨海波、王翠、 郭育培、刘影、宋丹、刘礼杰、赵美雪、张利平、赵胜杰、冉晓龙、曹俊伟、张玲 、杜燕玲 。 DB41/T 2595 —2024 1 猪急性腹泻综合征诊断技术 1 范围 本文件规定了猪急性腹泻综合征 的临床诊断、样品采集及处理、病毒分离与鉴定、反转录聚合酶链 式反应（ RT-PCR）和实时荧光 RT-PCR的技术要求。 本文件适用于猪急性腹泻综合征的 临床诊断和检测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本 文件。 SADS：猪急性腹泻综合征（ Swine acute Diarrhoea Syndrome ） SADS-CoV：猪急性腹泻综合征冠状病毒（ Swine acute Diarrhoea Syndrome Coronavirus ） RT-PCR：反转录 -聚合酶链式反 应（Reverse transcription -polymerase chain reaction ） FQ-PCR：荧光-聚合酶链式反应（ Fluorescence Quantitative -polymerase chain reaction ） EDTA：乙二胺四乙酸（ Ethylene diamine tetraacetic acid ） PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate buffered saline ） DEPC：焦碳酸二乙酯（ Diethypyrocarbonate ） cDNA：互补脱氧核糖核酸 （complementary DNA ） vero：非洲绿猴肾细胞（ Verda Reno ） 5 临床诊断 5.1 流行病学 5.1.1 SADS是由 SADS-CoV引起的一种新型猪肠道冠状病毒病，该病毒可感染不同日龄的猪，仔猪最 易感染，感染后 2 d～6 d发病，5日龄以内的仔猪病死率 最高可达90％以上， 8日龄以上的仔猪病死 率相对较低；成年猪感染后多数只出现轻度腹泻， 2 d～3 d后大部分猪可自行痊愈。 5.1.2 发病猪及带毒猪为主要的传染源。主要通过直接接触传播，病猪可通过粪 -口以及病毒污染的物 品、饲料、垫料、设施设备及地面等传播。 5.1.3 SADS一年四季均可发生，冬春季多发。 5.2 临床症状 发病仔猪出现急性腹泻 、呕吐，脱水、体重迅速下降 或死亡；成年猪感染出 现轻度腹泻。 DB41/T 2595 —2024 2 5.3 病理变化 小肠肠道变薄、变透明，肠内充满黄色水样物质，肠系膜充血；组织病理学检查，空肠和回肠内肠 绒毛萎缩、脱落， 肠绒毛上皮细胞变性、坏死 。 5.4 结果判定 易感动物 符合5.1且出现5.2临床症状、 5.3病理变化时，可判为 疑似猪急性腹泻综合征 。 6 样品采集及处理 6.1 主要试剂 6.1.1 0.01 mol/L PBS （pH 7.4），按A.1和A.2配制。 6.1.2 青霉素，浓度为 1000 IU/mL 。 6.1.3 链霉素，浓度为 500 IU/mL 。 6.2 用具 6.2.1 器械：解剖刀、剪刀、镊子、注射器及针头、组织匀浆仪等。 6.2.2 个人防护用具：防护服、防护镜、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等。 6.2.3 采样记录用品：采样单、记号笔、防水标签等。 6.2.4 其他：2 mL离心管、 0.22 µm微孔滤器、医用棉签、冰袋等。 6.3 样品采集和运输 6.3.1 粪便及组织样品 无菌采集疑 似SADS-CoV感染腹泻猪急性期的 新鲜粪便（ 1.0 g～2.0 g）或小肠中段（ 1.0 cm～ 2.0 cm），放入密封袋中，置于带有冰袋的保存箱中，送至实验室 ，附带的冰袋里的冰应未完全融化； 如样品不能被及时送到实验室，应置于 -20 ℃冰箱中保存，保存期应不超过 1个月。 6.3.2 血清样品 采集疑似 SADS-CoV感染猪的血液样品，每只不少于 5 mL，室温放置 12 h～24 h，分离血清，装入 离心管中，密封后冷藏或冷冻保存。 6.4 样品处理 及保存 6.4.1 粪便样品 取0.1 g～0.2 g新鲜粪便 置于2 mL离心管中，加入 0.01 mol/L PBS （pH 7.4，含终浓度 1 000 IU/mL 的青霉素、 500 IU/mL 的链霉素） 1.0 mL～2.0 mL，摇匀，经 3 000 r/min 离心10 min，取上清液，经 0.22 µm微孔滤器过滤，分装，－ 20 ℃保存备用。 如需长期保存，应置于 -80 ℃冰箱。 6.4.2 组织样品 取1.0 cm～2.0 cm小肠组织，用剪刀剪碎后放入 2 mL离心管中并加入 0.01 mol/L PBS （pH 7.4， 含终浓度 1 000 IU/mL 的青霉素、 500 IU/mL 的链霉素） 2.0 mL，用组织匀浆仪研磨，－ 20 ℃反复冻 融3次，摇匀，经 3 000 r/min 离心10 min，取上清液，经 0.22 µm微孔滤器过滤，分装，－ 20 ℃保 存备用。 如需长期保存，应置于 -80 ℃冰箱。 DB41/T 2595 —2024 3 6.4.3 血清样品 置于2 ℃～8 ℃冰箱中可保存一周，保存时间超过一周以上应置于 -20 ℃以下冷冻保存。 7 病原分离与鉴定 7.1 试剂 7.1.1 D-Hanks液。 7.1.2 细胞培养液 ，按A.3配制。 7.1.3 细胞维持液， 按A.4配制。 7.1.4 0.25％胰蛋白酶。 7.1.5 胎牛血清。 7.2 仪器设备 7.2.1 二级生物安全