ICS 65.020 CCS B 05 3715 聊城市 地方 标准 DB 3715/T 41—2023 羊肚菌液体菌种制备技术规程 2023 - 10 - 7发布 2023 - 11 - 7实施 聊城市市场监督管理局 发布 DB 3715/T 41 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由聊城市农业农村局提出、组织实施并归口。 本文件起草单位： 聊城市农业技术推广服务中心、莘县农业农村综合服务中心、聊城市东昌府区农 业技术推广服务中心、聊城市农业科学院、临清市青年路街道办事处农技站、阳谷县农业技术推广服务 中心、山东蒙恩现代有限公司。 本文件主要起草人：李莉、刘芳、吴怀英、宋凌云、王泽奇、姜新、张静、 杨红燕、申铜飞、刘晶、 张素芳、王远亮 、赵岑、何小春、苏静、王凤改、王光勇、付成龙 。 DB 3715/T 41 —2023 1 羊肚菌液体菌种制备技术规程 1 范围 本文件规定了羊肚菌液体菌种 制备的术语和定义、 生产要求、生产技术和档案管理等要求。 本文件适用于羊肚菌液体菌种的制备。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 150 压力容器 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB 50073 洁净厂房设计规范 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 NY/T 1935 食用菌栽培基质质量安全要 求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 液体菌种发酵罐 liquid strain fermentation tan k 食用菌液 体菌种培养的专用发酵设备，设备应符合 GB 150要求。 3.2 接种抢 inoculation gun 将液体菌种按无菌操作要求由发酵罐接种到固体培养机物料上的工具。 4 生产要求 4.1 人员要求 工作人员应该保持个人卫生，进液体菌种发酵车间必须穿戴经灭菌处理的工作服、口罩、鞋、帽。 4.2 产地环境要求 4.2.1 场所要求 生产场所应场地开阔、 路面硬化、 卫生清洁， 符合 NY/T 528 的环境卫生要求， 水源水质符合 GB 5749 要求。 4.2.2 厂房要求 DB 3715/T 41 —2023 2 厂房设计应符合 NY/T 528要求，发酵罐菌种培养室应符合 GB 50073 要求。冷却区应卫生干净、接 种区应正压无菌、培养室应能控温、通风。 4.3 生产设备与设施 4.3.1 生产设备与用 具 磅秤、天平、高压蒸汽灭菌锅、发酵罐、水净化处理设备、恒温摇床、超净工作台、调温设备、除 湿设备、 恒温培养箱、 冰箱、显微镜等及常规用具。压力容器， 应经政府有关部门检验合格， 符合 GB 150 要求。应具有备用电源。 4.3.2 基本设施 发酵罐菌种培养室 应有调温、通风设施，空间洁净度应达到百级。菌种检验室有相应的实验检测设 备、制种用的灭菌设施和 常规用具。 5 生产技术 5.1 工艺流程 母种制备 → 摇瓶液体菌种 制备 → 发酵罐液体菌种生产 → 放罐接种 5.2 母种制备 母种制备应符合 NY/T 528 的规定。 5.3 摇瓶液体菌种制备 5.3.1 培养基制备 培养基按下列配方配制，豆粕 0.5 %，葡萄糖 2 %，磷酸二氢钾 0.3 %，硫酸镁 0.15 %，原料应 符合 NY/T 1935 的规定。取定量的纯水放入烧杯，煮沸后将上述原料按比例依次倒入烧杯中完全溶解 ,制成 培养液，冷却备用。 5.3.2 摇瓶装液量 采用1 000 mL三角瓶，装液量为 500 mL用纱布和牛皮纸封口。 5.3.3 灭菌 采用高温高压灭菌，在 121 ℃，压力约 1.5 g/m2条件下保持 30 min。 5.3.4 接种 培养基冷却至常温，在无菌条件下将 3～4 块2 cm3的母种菌块接入摇瓶内 。 5.3.5 培养 静置48 h后置于恒温摇床， 24 ℃～25 ℃、140 r/min～160 r/min，培养4 d～6 d。摇瓶液体菌种培 养液应澄清透明，无杂菌、无异味；镜检无杂菌、菌丝浅白色且色泽均匀、形态正常；菌丝球密度达 70 %～80 %，菌丝球较小且均匀（菌球直径小于 0.5 cm） ，菌丝体生物量大于 8 g/L，均匀悬 浮于液体培 养基中，不分层。 5.3.6 贮存 DB 3715/T 41 —2023 3 摇瓶液体菌种若不能及时使用，可在 0 ℃～4 ℃度低温保藏不超过 10 d。 5.4 发酵罐液体菌种生产 5.4.1 杂菌检测 接种前2 d应对摇瓶液体菌种进行检测，用注射器吸取少量菌液注射到培养基斜面上， 36 ℃培养 24 h，观察有无杂菌 。 5.4.2 罐体清洗及注水 生产前，严格检测罐体：内检与外检，及时排查问题，确保安全生产。检查后，罐体注入纯净水， 把各阀口套上保护套 并紧牢固；打开各阀口用水冲洗干净，冲洗好后关闭阀门注入纯净水，液位与过滤 器下沿齐平。 5.4.3 投料 磨细玉米面 4 g/L，磨细豆粉 5.6 g/L，全麦粉 1.25 g/L，白糖5 g/L，葡萄糖 6.25 g/L ，磷酸二氢 钾0.325 g/L，硫酸镁 0.19 g/L，0.15 mL/L。按照配方要求称取相应重量的原料，倒入拌料桶中，加注 纯净水搅拌至无颗粒，倒入罐内，最后加入消泡剂。 5.4.4 封罐灭菌 用洁净的湿毛巾把罐口擦干净，盖上罐盖，对角拧紧螺栓，半分位打开上排气阀和接种阀排净罐内 空气，然后关闭阀门。打开蒸汽阀门对培养液加热，然后打开进气阀进气搅拌，蒸汽压力由小到大，蒸 气压力介于 0.2 Mpa～0.3 Mpa。当温度达到 100 ℃时，关闭进气阀。持续加热到罐内温度升到 124 ℃～ 126 ℃，调节排气阀 ，控压在0.14 Mpa～0.15 Mpa之间， 恒温维持 60 min， 关闭所有阀门 (由外向内关 )， 灭菌完成。 5.4.5 冷却 打开冷却水管开关对培养液进行降温；当罐压达到 0.05 Mpa～0.07 Mpa时，此时可以打开进气阀通 气搅拌，罐内温度降到 28 ℃以下时，关闭冷水管、进气和排气阀，罐体压力保持 0.05 Mpa。 5.4.6 接种前准备 将排气阀开到最大排气，将火焰封口托板固定在接种口下方并放置酒精浸湿的脱脂棉，松开保护套 卡环并向外拔出约 1 cm，当排气阀有微弱气体排出时，关闭排气阀，准备接种。 5.4.7 接种与培养 5.4.7.1 接种量 接种比例为 1：800。 5.4.7.2 杀菌消毒 用酒精棉擦拭接种摇瓶软管， 点燃托板上的脱脂棉对接种口和摇瓶软管口进行火焰消毒并火焰封口。 5.4.7.3 接种 迅速拔下保护套和摇瓶软管口的棉塞，将软管插入接种口，撤掉火焰及托板，用卡环箍紧软管和接 种口。 缓慢打开接种口排气阀门排出罐体和软管内少量气体后， 按住摇瓶口的硅胶塞， 高举并倾斜摇瓶，DB 3715/T 41 —2023 4 缓捏软管 使菌液流入罐内，完毕后用干净的脱脂棉对接种口内壁清理，关闭接种口阀门。 5.4.7.4 培养 打开进气和排气阀， 对接种后的培养基进行搅拌并将压力保持在 0.01 Mpa， 温度控制在 15 ℃～18 ℃ 培养。再培养 2 d～3 d即可接种，培养的后 3 d，因菌液粘稠，菌丝量增加， 宜适当加大通气量搅拌。 5.4.7.5 杂菌检测 第4 d进行取样检测，先进行排液， 开阀门顺序为由内向外 ，排液后， 阀门关闭由外向内。取样时 ， 点燃托板上的脱脂棉对取样口火焰封口 。取样完后用干净的脱脂棉对取样口内壁清理 。样品在36 ℃培 养24 h，无杂菌出现。 5.5 放罐接种 5.5.1 菌包培养料准备 60 %的麦粒，煮熟煮透无白芯 ；40 %玉米芯，玉米芯颗粒大小 在0.8 cm～1 cm，玉米芯泡透。将煮 熟的麦粒用其干重 1.5 %的轻质碳酸钙和 5 ‰磷酸二氢钾拌匀，浸泡过的玉米芯用其干重 2 %的轻质碳 酸钙拌匀，再 将二者拌匀，含水量以 60 %～65 %为宜。用生石灰调 pH值到10～11之间。 5.5.2 装袋 5.5.2.1 包装规格 采用17 cm×36 cm×0.5 cm聚丙烯袋 包装。 5.5.2.2 菌包重量 每包重0.8 kg左右。 5.5.2.3 封口 套环+扣盖。 5.5.3 菌袋消毒灭菌 菌种袋采用高温高压消毒。将待接种的菌袋放入灭菌柜，抽真空两次，阶梯升温，升温到 105 ℃保 持60 min，升温到 115 ℃保持30 min，升温到 121 ℃，达到灭菌温度保持 200 min，再焖置 30 min。 5.5.4 接种环境 应符合GB 50073 要求。 5.5.5 液体菌种接种器消毒 接种枪用酒精灯火焰消