ICS 65.020.02 CCS B 05 3401 安徽省合肥市 地方标准 DB 3401/T 340—2024 玉米单倍体 DH系育种 芽苗加倍法 Breeding of maize haploid DH lines —Bud and seedling doubling method 2024 - 12 - 23发布 2024 - 12 - 23实施 合肥市市场监督管理局 发布 DB 3401/T 340 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构部不承担识别专利的责任。 本文件由合肥市农业农村局提出并归口。 本文件起草单位：合肥丰乐种业股份有限公司、安徽农业大学。 本文件主要起草人 : 徐丽媛、马庆、崔明亮、任正鹏、王利明、赵阳、李晓玉、蔡荣号、顾龙江、 佘宁安、乔东利、韩青成、胡文黎、孟令来、王丽梅、马小川、刘芳。 DB 3401/T 340 —2024 1 玉米单倍体 DH系育种 芽苗加倍法 1 范围 本文件描述了玉米单倍体 DH系的芽苗加倍育种方法。 本文件适用于采用芽苗加倍法开展的玉米单倍体 DH系育种。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DH系育种 Double Haploid Breeding 一种利用诱导系诱导产生单倍体植株，再通过染色体组加倍（自然加倍或药剂处理）使植物恢复正 常染色体数的育种方法。 4 设备用具、试剂与材料 设备 4.1 发芽箱、通风橱。 用具 4.2 发芽纸、纱布、量筒（ 100ml）、量杯（ 1L）、水桶、手术刀、不锈钢方盆、育苗钵 。 试剂与材料 4.3 秋水仙素、二甲基亚砜（ DMSO）、乙醇、次氯酸钠 溶液、营养土。 试剂均为分析纯。 5 方法与步骤 单倍体加倍 5.1 5.1.1 催芽 DB 3401/T 340 —2024 2 单倍体种子带有明显的颜色标记，籽粒糊粉层着色、盾状体无色素。人工挑选出玉米单倍体种子， 使用数粒仪进行数粒， 并记录。 将挑选好的种子倒入不锈钢方盆中使用自来水清洗， 去除杂质后使用 75% 乙醇消毒 1min，再用2%次氯酸钠溶液消毒 10min，倒出消毒水之后用纯水清洗 3次。纯水规格按照 GB/T 6682的规定执行。 灭菌湿毛巾平铺在消过毒的不锈钢方盆中，在湿毛巾上放一张发芽纸，将消毒洗净的种子平铺在发 芽纸上，上面使用灭菌湿毛巾盖好，并扣同样 大小的盆，置入发芽箱中，保持箱内湿度 50%-80%、温度 25℃～28℃。 5.1.2 切芽 发芽后第 4天开始观察，去除根部和芽尖有红色的假单倍体种子，将长至 2cm以上玉米幼芽切除芽鞘 尖端中空部分后，放入纱网袋中。 5.1.3 秋水仙素配置 取1g秋水仙素溶解于 33.33ml无菌的二甲基亚砜（ DMSO）溶液中，过滤除菌 后加无菌水 定容为0.06% 浓度的母液，放于棕色瓶中避光保存， 0℃～4℃冰箱里保存备用 ，保质期约一年 。无菌水规格按照 GB/T 6682的规定执行，秋水仙素配置按 GB 19489的规定执行。 5.1.4 种子芽浸泡 向水桶中倒入配置好 的0.06%秋水仙素溶液，漫过切好的种子芽，浸泡 6h～8h。 5.1.5 种子芽清洗 倒出秋水仙素废液，用清水浸泡种子芽 30min，再用流水清洗 3次（清洗过程中避免伤到芽和根）。 清洗后的种子芽及时送至温室进行穴盘移栽。 5.1.6 种子芽移栽 每个穴盘中移栽一株苗，使用生根粉灌根，喷洒叶面肥，在幼苗长到 4～5片叶时移栽到大田。移栽 后保证土壤水分充足、无杂草。 5.1.7 加倍材料的筛选及田间管理 5.1.7.1 筛选 观察植株高度、颜色和散粉性，在 7叶～8叶期去除高大、绿色的植株。 5.1.7.2 田间管理 对地块进行精细平整，保证基肥充裕与水分充足，及时追肥、除草、防治病虫害。 5.1.8 授粉 5.1.8.1 授粉步骤 散粉期每天早晨观察雌穗，雌穗吐丝前进行套袋，当单倍体植株有花药外露并有明显花粉产生时， 进行自交授粉。授粉后雌穗替换为不同颜色袋子，次日有花粉时，再进行一次自交授粉，严格套袋。 若雄穗开始散粉，雌穗还未吐丝，则在雌穗包叶上端剪掉 1/4左右露出花丝，进行套袋，次日自交 授粉。隔天再自交授粉一次。 DB 3401/T 340 —2024 3 5.1.8.2 授粉时间 授粉时间宜为晴天上午 10:00左右，气温宜在 20℃～28℃之间。 5.1.9 DH系体籽粒的收获、保存 玉米果穗成熟后单穗收获，干燥 后单穗脱粒，在不超过 10℃、通风良好的环境中保存，避免籽粒丢 失、混杂、损害。 DH系籽粒鉴定及扩繁 5.2 5.2.1 DH系籽粒播种 单穗籽粒多于 5粒时，每粒一个穴孔进行播种；单穗籽粒等于或少于 5粒时，可多粒播，确保正常出 苗。 5.2.2 DH系鉴定 出苗后， 如果植株长势整齐一致， 且不是杂交种株型， 可以确定为纯合 DH自交系。 若植株分离严重， 或带有诱导系标记性状，应及时淘汰。 5.2.3 DH系扩繁 将确认为纯合 DH系的材料自交授粉， 授粉要求见 5.1.8.1。 成熟后获得大量自交籽粒， 用于育种。 _________________________