ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31801—2015 丁香疫霉菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPhytophthorasyringaeKleb. 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:杜洪忠、罗加凤、吴品珊、严进。 ⅠGB/T31801—2015 丁香疫霉菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了丁香疫霉菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于针对丁香疫霉菌寄主的苗木、枝条、枝叶、果实及其夹带土壤和介质中丁香疫霉菌的 鉴定。 2 仪器和用具 2.1 仪器 生物显微镜,超净工作台,光照培养箱,电子天平(1/1000g),高压灭菌锅,冰箱,PCR扩增仪,荧光 PCR扩增仪,电泳仪,凝胶成像仪,高速冷冻离心机,恒温水浴锅。 2.2 用具 烧杯,三角瓶,量筒,试管,培养皿,酒精灯,镊子,剪刀,解剖刀,接种针,载玻片,盖玻片,塑料研杵, 移液器,移液器吸头,离心管,液氮罐。 3 试剂、材料和培养基 3.1 试剂 β-谷甾醇,匹马霉素(pimaricin),氨苄青霉素钠盐(ampicillin),利福平钠盐(rifampicin),五氯硝基 苯(pentachloronitrobenzene),恶霉灵(hymexazol),CaCO3,琼脂糖,Tris-HCl,MgCl2,HCl,乙二胺四乙 酸四钠盐(EDTA),NaOH,NaOAc,KCl,Tris,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),TAE,无水乙醇(etha- nol),三氯甲烷(chloroform),异丙醇(isopropanol),异戊醇(isoamylalcohol),SYBRGreenI核酸染料, 蛋白酶K,TaqDNA聚合酶,dNTP,通用引物ITS5和ITS4,实时荧光PCR引物PS-F和PS-R及Taq- Man-MGB探针PS-Pr。 3.2 材料 琼脂粉,V8汁,夏栎叶片或苹果或梨,鲜橙皮或杜鹃叶片。 3.3 培养基 PDA培养基,V8培养基,V8鲜橙皮培养基,V8杜鹃叶片培养基,选择性培养基PARPH-V8。具 体配方参见附录A。 4 检疫鉴定方法 4.1 症状检查 检查寄主植物的根、茎、叶、果实等部位,对有枯萎、果腐、根腐、颈腐和流胶症状的植物,以及根周围 1GB/T31801—2015 的土壤和介质取样送实验室做进一步检验。丁香疫霉菌为害症状参见附录A。 4.2 寄主组织分离培养 可疑症状的根、茎、叶、果实用流水冲洗表面约15min,取根、茎、叶、果实果皮的病健交界处,剪成 5mm×5mm小块,75%乙醇消毒30s,无菌水冲洗3次,吸干水分,置选择性培养基PARPH-V8上, 17℃黑暗培养。 培养4d~6d后,组织周围培养基上长出稀疏菌落,挑取菌落边缘菌丝块转入V8培养基或PDA 培养基纯化,17℃黑暗培养。 4.3 土壤和介质诱集 称量土块或介质25g,碾碎放入500mL灭菌洁净烧杯中。无菌水将土样或介质润湿(无流动水), 保鲜膜覆盖封口,置于17℃~20℃黑暗条件下放置3d~5d。 每份样品加灭菌蒸馏水,水面距土表4.0cm,然后加入10片左右直径8mm~10mm的新鲜夏栎 (Quercusrobur)叶片或未成熟的苹果或梨果实的小切片,切片大小以漂浮在水面为宜,Parafilm膜封口 保湿,17℃~20℃黑暗条件下放置。 4.4 诱集检查和培养 诱集2d~3d后,观察夏栎叶片或苹果或梨附近是否有棕色病变区,从变色的病健交界处取5mm× 5mm小块,75%乙醇消毒30s,置V8培养基或选择性培养基PARPH-V8,17℃黑暗培养。 培养4d~6d后,组织周围培养基上长出稀疏菌落,挑取菌落边缘菌丝块转入V8培养基纯化或 PDA培养基,17℃黑暗培养。 4.5 孢子囊和菌丝膨大体诱发 取纯化后菌落边缘菌丝块,置于盛有10mL无菌水的培养皿中,17℃~20℃黑暗条件下诱发孢子 囊和菌丝膨大体,48h后观察菌丝块周围孢子囊和菌丝膨大体产生情况。 4.6 卵孢子诱发 取纯化后菌落边缘菌丝块,置于加入β-谷甾醇(20mg/L)或植物油(玉米油、亚麻籽油、麦芽油)的 V8培养基中,黑暗条件下8℃~10℃低温培养4周。 如果寄主材料是柑橘属的果实,则将纯化后菌落边缘菌丝块置于V8鲜橙皮培养基或V8杜鹃叶片 培养基,10℃黑暗培养,7d后观测病菌卵孢子产生情况。 4.7 DNA提取 收集分离到的病菌菌丝,采用CTAB法提取核酸。参见附录B。 4.8 实时荧光PCR检测 实时荧光PCR引物序列为PS-F:5'-GTCTGGCTTCGGCTGGAT-3'和PS-R:5'-AGTGGGC- TACTAGCTCCAGGC-3',TaqMan-MGB探针PS-Pr:5'-(FAM)TGGCGACCGCTCTGA(NFQ- MGB)-3',探针5'端标记的荧光报告基团为FAM,3'端标记的非荧光猝灭基团为MGB。 反应体系(25μL):样品DNA1μL,10×PCR缓冲液2.5μL,25mmol/LMgCl22μL,2.5mmol/L dNTPs2μL,10μmol/LPrimers各1μL,10μmol/L探针PH-Pr1.5μL,5U/μLTaqDNA聚合酶 0.3μL,ddH2O13.7μL。 反应循环为94℃10min;94℃15s,56℃60s,循环40次。 2GB/T31801—2015 4.9 ITS基因检测和序列比对分析 可以选择利用真菌通用引物PCR扩增后测序比对的分子方法。 利用真菌通用引物ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和ITS4(5'-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3')进行扩增。 反应体系(25μL):样品DNA1μL,10×PCR缓冲液2.5μL,25mmol/LMgCl22μL,2.5mmol/L dNTPs2μL,10μmol/LPrimers各1μL,5U/μLTaqDNA聚合酶0.3μL,ddH2O15.2μL。同时设 置空白对照,以Tris-EDTA缓冲液代替DNA样品。 PCR反应条件为:94℃4min;95℃1min,56℃30s,72℃45s,35个循环;72℃10min;4℃ 保存。 PCR产物的检测,在1×TAE电泳缓冲液中,1.5%琼脂糖(含SYBRGreenI核酸染料)凝胶电泳, 5V/cm,凝胶成像仪分析结果。如有900bp左右大小的条带出现,将扩增产物进行序列测定。 将测序后的序列与NCBI网站GenBank中公开发表的Phytophthorasyringae的序列进行 BLAST分析。 5 鉴定特征 5.1 生物学特征 5.1.1 菌落特征 丁香疫霉菌在V8培养基和PDA培养基上生长较为缓慢。在V8培养基上菌落稀疏,呈放射状、星 状或菊花花瓣状,菌落的花瓣区域较尖、窄,菌落形态图参见附录C。在PDA上菌落边缘约呈花瓣状, 乳白色,菌丝体浓密,菌落中央区域皱孔状。 5.1.2 病菌形态 无性生殖阶段孢子囊梗呈单歧聚伞花序状分枝。孢子囊具有不完全的乳头状突起,形状为卵形或 倒梨形,不易脱落,单独生在顶端或整个集结在一个孢子囊梗上。孢子囊大小为(21.0μm~75.0μm)× (11.0μm~42.0μm),平均47.0μm×30.0μm,长宽比在1.1∶1至2.1∶1之间。孢子囊不易脱落,不 增殖,但可直接在附近萌发产生一个新的孢子囊。孢子囊具有平的盖,裂开释放游动孢子,游动孢子卵 形,侧生二根鞭毛。 病菌易产生菌丝膨大体,念珠状,卵形、球形或不规则形,常萌发产生较细的菌丝,菌丝膨大体中的 内含物最终会逐渐释放殆尽,成为空壳。 病菌为同宗配合,藏卵器球形,直径23.4μm~40.0μm;卵孢子充满藏卵器,通常为圆形,黄色,大 小为20.1μm~34.7μm;雄器单个或数个,平滑,多侧生。 丁香疫霉菌的形态图参见附录C。 5.1.3 与近似种的形态区别 与丁香疫霉菌在形态上较为近似的是冬生疫霉菌(Phytophthorahibernalis)。主要区别为丁香疫 霉菌落的花瓣区域较尖、窄,孢子囊不易脱落,具有菌丝膨大体,雄器多侧生;冬生疫霉菌落的花瓣区域 较宽,孢子囊易脱落,无菌丝膨大体,雄器多围生,参见附录D。 5.2 实时荧光PCR检测 若阴性对照及空白对照的Ct值≥40,供试菌Ct值≤36,可判定为阳性。 3GB/T31801—2015 5.3 ITS序列比对 经BLAST分析,PCR扩增到的ITS基因序列与NCBI网站GenBank中登录号为AF380146.1的 Phytophthorasyringae的序列同源性99%~100%,则判定为阳性。 6 结果判定 病菌的培养性状和形态特征与5.1的描述一致,且实时荧光PCR检测结果呈阳性,或ITS序列比 对99%~100%同源,可判定为丁香疫霉菌。 7 样品和档案保存 7.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出丁香疫霉菌的样品应保存于10℃冰箱中,至少保存 6个月,以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 7.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为丁香疫霉菌的