ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31795—2015 番茄黑环病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofTomatoblackringvirus 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫 局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:杨翠云、于翠、郭京泽、魏亚东、邓丛良、乔艳艳、崔学慧、胡培龙、孙娟。 ⅠGB/T31795—2015 番茄黑环病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了番茄黑环病毒的DAS-ELISA、RT-PCR、免疫磁珠RT-PCR、实时荧光RT-PCR、鉴 别寄主检测和免疫电镜等检疫鉴定方法。 本标准适用于植物材料,包括无性繁殖材料、种子和苗木中番茄黑环病毒的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T1840 植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 仪器设备、设施、用具和试剂 3.1 仪器设备 酶标仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平(感量0.001g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成 像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、超低温冰箱(-80℃)、高压灭菌锅、制冰机、微波 炉、涡旋振荡器。 3.2 设施 植物隔离检疫圃。 3.3 用具 可调式微量移液器(2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL)及相应的无RNase吸头、无RNase离 心管、PCR管、研钵、样品袋、标签、镊子、放大镜、磁力架等。 3.4 主要试剂 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。 TBRV抗体、磁珠(具有超顺磁性的聚苯乙烯珠子,直径280nm,表面标记有甲苯磺酰基)、Trizol、 焦碳酸二乙酯(DEPC)、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、DNA分子标记、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。 血清学和分子生物学检测试剂配制见附录B。 4 症状观察及抽样 4.1 症状观察 现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状,TBRV为害症状描述参见附录A。 1GB/T31795—2015 4.2 抽样 发现有病毒为害症状的植物材料直接送检;未发现症状的,则按SN/T2122中规定进行抽样,并送 实验室检疫鉴定。 5 检疫鉴定 5.1 双抗体夹心酶联免疫吸附方法(DAS-ELISA) 对种苗、球茎或由种子催生长出的叶片研磨,并加入抽提缓冲液按1∶10(质量∶体积)的比例稀 释,制备的汁液分别盛装于离心管中,离心后吸取上清液作为待测样品,并设阳性对照、阴性对照和空白 对照。具体操作步骤见附录C。 5.2 RT-PCR方法 将种苗、种球或种子催生长出的叶片液氮研细,取0.1g用于提取植物总RNA。具体操作步骤见附 录D。 5.3 免疫磁珠RT-PCR方法 首先进行免疫磁珠的分离,包括:清洗磁珠、抗体包被和抗原吸附,然后RT-PCR反应。具体操作 步骤见附录E。 5.4 实时荧光RT-PCR方法 将种苗、种球或种子催生长出的叶片液氮研细,取0.1g用于提取植物总RNA。具体操作步骤 见附录F。 5.5 鉴别寄主测定方法 在栽种于植物隔离检疫圃中的鉴别寄主植物真叶长出后用于摩擦接种,对DAS-ELISA或 RT-PCR检测TBRV呈阳性的样品,加入适量接种缓冲液研磨后接种鉴别寄主。当任意一种鉴别寄主 植物出现如下描述症状时,即可判定接种成功: a) 昆诺藜(Chenopdiumquinoa)或苋色藜(Chenopdiumamaranticolor):接种叶出现局部褪绿 斑,然后出现系统褪绿斑驳。 b)黄瓜(Cucumissativus):接种叶出现局部褪绿斑或小型坏死环斑或黄斑,后出现系统环线脉, 畸形。 c)“Prince”菜豆(Phaseolusvulgarisvar.Prince):接种叶出现局部褪绿、坏死或畸形。 d)矮牵牛(Petuniahybrida):接种叶出现局部枯斑或坏死环斑,然后出现系统褪绿环斑、线纹或 明脉。 e)番杏(Tetragoniaexpansa):接种叶出现细轮纹,后出现环斑。 f)黄花烟(Nicotianarustica):接种叶产生局部褪绿、坏死斑或环斑。 g)白肋烟(N.tabacumWhiteburley)或三生烟(N.tabacumSamsunNN):接种叶产生局部坏 死环和斑点,系统斑点、环或者线条斑。 h)克利夫兰烟(N.clevelandii):接种后接种叶产生局部环斑。 5.6 免疫电镜方法 利用番茄黑环病毒抗血清富集植物材料中的病毒,在透视电子显微镜下观察病毒粒子的形态特征, 2GB/T31795—2015 具体操作步骤按照SN/T1840规定进行。如观察到直径为28nm的球状病毒粒子大量聚集或者有被 抗体修饰的现象,即可判定免疫电镜结果阳性。 6 结果判定 样品经DAS-ELISA或者RT-PCR检测结果为阴性,判定该样品不携带番茄黑环病毒。 样品经DAS-ELISA检测为阳性,如果RT-PCR或者免疫磁珠RT-PCR结果阳性,且序列测定结 果证实与所检测的番茄黑环病毒一致;或者经实时荧光RT-PCR检测为阳性时,可判定样品携带番茄 黑环病毒。 样品经DAS-ELISA或者RT-PCR检测结果为阳性,经免疫电镜观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄 主植物出现相应的症状时,可判定样品携带番茄黑环病毒。 7 样品保存与记录 7.1 样品保存 经检测确定携带番茄黑环病毒的样品,应妥善保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在干燥 室温环境中;种苗、鳞球茎等样品保存在-80℃冰箱中,做好登记和标记工作。 7.2 记录 样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检疫员的签字等。酶联免疫吸附测定法 检测应有酶联板反应的数值,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片,免疫电镜检测需要有电镜图片, RT-PCR和免疫磁珠RT-PCR检测应有电泳图及序列测定分析结果。实时荧光RT-PCR检测需要有 荧光曲线图与Ct值。 3GB/T31795—2015 附 录 A (资料性附录) 番茄黑环病毒相关信息 A.1 番茄黑环病毒基本信息 中文名:番茄黑环病毒 学名:Tomatoblackringvirus 缩写:TBRV 分类地位:豇豆花叶病毒科(Comoviridae),线虫传多面体病毒属(Nepovirus)。 传播途径:由土壤腐生线虫长针线虫属(Longidorussp.)传播,线虫介体只能短距离传播。TBRV 可在超过15个属的24种以上的植物中种传,通过种子和土壤随运输过程传播,被害多年生植物的繁殖 材料也可以传播病毒。 A.2 方法原理 病毒粒子的形态特征、为害症状、血清学特性和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据。采 用DAS-ELISA、RT-PCR、免疫磁珠RT-PCR、实时荧光RT-PCR、免疫电镜和鉴别寄主反应等方法进 行番茄黑环病毒的检疫鉴定。 番茄黑环病毒有很多株系,所以异名较多:大豆环斑病毒Beanringspotvirus;甜菜环斑病毒Beet ringspotvirus;芹菜黄脉病毒Celeryyellowveinvirus;莴苣环斑病毒Lettuceringspotvirus;马铃薯 束状病毒Potatobouquetvirus;马铃薯伪奥古巴病毒Potatopseudo-aucubavirus。其中,甜菜环斑病 毒的核苷酸序列与TBRV其他株系的核苷酸序列差异较大,附录F的实时荧光RT-PCR方法不适合甜 菜环斑病毒的检测。 根据血清学上的差异,番茄黑环病毒的株系主要属于两个血清型:苏格兰血清型(S)和德国血清型 (G)。S血清型主要是莴苣环斑株系和马铃薯束状株系;G血清型主要是甜菜环斑株系和马铃薯伪奥 古巴株系。而芹菜黄脉株系则居于二者之间。 A.3 生物学特性 A.3.1 主要寄主 番茄黑环病毒的寄主范围很广,可以广泛侵染单子叶、双子叶的草本和木本植物。包括其中重要的 经济作物,如葡萄和其他果树、甜菜、马铃薯和蔬菜(葱属、甜菜属、芸薹属、莴苣属、番茄属和菜豆属的一 些种)以及观赏植物,它还能侵染乔木和灌木以及一些杂草品种。 主要寄主包括:番茄(Lycopersiconesculentum),韭葱(Alliumporrum),芹菜(Apium graveolens),甜菜(Betavulgarisvar.saccharifera),莴苣(Lactucasativa),菜豆(Phaseolus vulgaris),马铃薯(Solanumtuberosum),黄瓜(Cucumissativus),朝鲜蓟(Cynarascolymus),唐菖蒲 (Gladiolushybrids),黑莓(Rubusfruticosus),覆盆子(Rubusidaeus),茄子(Solanummelongena),葡 萄(Vitisvinifera),黑穗醋栗(Ribesnigrum),桃子(Prunuspersica),瑞典芜菁(Brassicanapusvar nap